金水宝胶囊对肝纤维化大鼠模型TIMP-1及HA等的影响

曹正柳， 资晓飞， 熊耀斌， 谢庆斌， 傅 缨， 冷红文， 李剑琦， 俞 红， 龚媛媛

(1.南昌大学第二附属医院，江西南昌330006;2.江西省医学科学研究所，江西南昌330006;3.江西济民可信医药有限公司，江西南昌330096)

肝纤维化是肝损伤持续存在，组织发生修复反应时，因细胞外基质合成、降解与沉积不平衡而引起的病理过程，是慢性肝病重要的病理特征，也是进一步向肝硬化发展的主要中间环节［1］。本试验以皮下注射四氯化碳诱导大鼠肝损伤，形成肝纤维化动物模型。通过观察金水宝胶囊对肝纤维化模型大鼠TIMP—1及HA等的影响，研究金水宝胶囊抗肝纤维化的疗效及可能的机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物 普通级SD大鼠68只，体质量180～200 g，雄性，分笼饲养，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司处购买，动物合格证2008-0016。

1.2 实验药物 金水宝胶囊(蝙蝠蛾拟青霉Cs-4发酵菌粉)由江西济民可信金水宝制药有限公司生产提供。

1.3 试剂 四氯化碳，分析纯，天津市恒兴化学试剂公司，批准号:20080908，以纯橄榄油配成40%的油剂。

2 实验方法

2.1 分组与用药 随机分成5组。各组用药剂量按照实验动物研究“等效剂量”计算方法确定［2］。除A组外，各组均用CCl4造模。A组:空白对照组，10只，同等条件下喂养，不给药，各鼠每天灌服2 mL生理盐水。B组:模型对照组，16只，不给药，各鼠每天灌服2 mL生理盐水。C组:金水宝胶囊(蝙蝠蛾拟青霉Cs-4)小剂量治疗组，14只，以金水宝胶囊(蝙蝠蛾拟青霉Cs-4)按40 mg/100 g体质量/日灌胃。D组:金水宝胶囊(蝙蝠蛾拟青霉Cs-4)中剂量治疗组，14只，以金水宝胶囊(蝙蝠蛾拟青霉Cs-4)按80 mg/100 g体质量/日灌胃。E组:金水宝胶囊(蝙蝠蛾拟青霉Cs-4)大剂量治疗组，14只，以金水宝胶囊(蝙蝠蛾拟青霉Cs-4)按160 mg/100 g体质量/日灌胃。

2.2 模型制作 分组完成后，第1周先普通饲养5 d，第2 周开始造模，喂以普通饲料。B、C、D、E 4 组大鼠每只第一次皮下注射40%CCl4橄榄油0.5 mL/100 g体质量，A组大鼠则每只给予60%橄榄油生理盐水0.5 mL/100 g体质量皮下注射。以后B、C、D、E 4组大鼠每次每只皮下注射40%CCl4橄榄油0.3 mL/100 g体质量，每周两次。A组大鼠每只给予皮下注射60%橄榄油生理盐水0.3 mL/100 g体质量，每周两次。造模组至第5周开始每周末随机处死两只大鼠观察肝脏病理改变，到第9周发现汇管区纤维组织增生，并向肝组织内延伸，肝小叶结构紊乱，未见假小叶形成，参照2000年中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订标准［3］，肝纤维化形成，继续按原方案注射CCl4维持大鼠肝纤维化程度，直到治疗完毕。同时开始给各组大鼠按要求每天各自灌服相应药物，连续4周。在末次灌胃后3 d处死全部大鼠，取标本供检。

3 观察内容

3.1 一般情况 每次注射CCl4前称体质量1次，以调整用药剂量。逐日观察大鼠活动、进食量、毛色等情况，并记录死亡数。

3.2 肝功能指标采用全自动生化分析仪测定血清ALB水平。

3.3 HA、PC-III、IV-C 采用放射免疫分析法测定，试剂盒由上海海军医学研究所提供，严格按照测定盒说明书方法操作。

3.4 TIMP－1采用免疫组化方法测定，试剂盒由上海西唐生物科技有限公司提供，严格按照测定盒说明书方法操作。

4 试验结果

4.1 金水宝胶囊对肝纤维化大鼠模型ALB的影响模型对照组ALB较空白对照组降低，各治疗组ALB较模型对照组升高，各治疗组内部之间对ALB影响没区别(P＞0.05)。结果见表1。

表1 金水宝胶囊对肝纤维化大鼠模型ALB的影响 (±s)

表1 金水宝胶囊对肝纤维化大鼠模型ALB的影响 (±s)

注:与空白组对比，*P ＜0.05;与模型组对比，﹟ P ＜0.05。

组别 动物/只 ALB/(g/L)10 36.9 ±1.79模型对照组 11 30.36 ±1.86*金水宝胶囊小剂量治疗组 12 32.91±2.47*﹟金水宝胶囊中剂量治疗组 12 33±2.80*﹟金水宝胶囊大剂量治疗组 12 33.58±2.11*﹟空白对照组

4.2 金水宝胶囊对肝纤维化大鼠模型肝纤维化相关指标的影响 模型对照组HA较空白对照组明显升高，但是各治疗组与模型对照组相比HA均明显降低，中、大剂量治疗组较小剂量治疗组HA降低更明显(P＜0.05)，不过中剂量治疗组和大剂量治疗组之间对HA影响没统计学差异(P＞0.05)，治疗后大剂量治疗组HA与空白对照组无统计学差异(P＞0.05)。模型对照组PC-III较空白对照组明显升高，但是中、大剂量治疗组与模型对照组相比，PCIII明显降低，小剂量治疗组无明显降低PC-III的作用。模型对照组Ⅳ-C较空白对照组明显升高，但大剂量治疗组Ⅳ-C较模型对照组明显降低，治疗后大剂量治疗组Ⅳ-C与空白对照组无统计学差异(P＞0.05)。结果见表2。

表2 金水宝胶囊对肝纤维化大鼠模型肝纤维化相关指标的影响(±s)

表2 金水宝胶囊对肝纤维化大鼠模型肝纤维化相关指标的影响(±s)

注:与空白组对比，*P ＜0.05，□P ＞0.05;与模型组对比，﹟ P ＜0.05 ，△P ＞0.05。

组别 动物/只 HA/(ng/mL) PC-III/(ng/mL) Ⅳ-C/(ng/mL)空白对照组10 138.68 ±18.47 43.85 ±3.11 84.37 ±7.67模型对照组 11 293.12 ±82.60* 59.63 ±8.24* 111.14 ±22.63*金水宝胶囊小剂量治疗组 12 210.58±27.13*﹟ 53.998±7.89＊△ 118.39±29.75＊△金水宝胶囊中剂量治疗组 12 174.55±41.46*﹟ 52.16±6.94*﹟ 99.85±30.86□△金水宝胶囊大剂量治疗组 12 147.91±31.59□﹟ 51.19±7.06*﹟ 70.79±26.78□﹟

4.3 金水宝胶囊对肝纤维化大鼠模型TIMP-1的影响 模型对照组TIMP-1较空白对照组明显升高，但中、大剂量治疗组TIMP-1较模型对照组明显降低，且与空白对照组无统计学差异(P＞0.05)。大剂量治疗组与中剂量治疗组对TIMP-1的影响作用无统计学差异(P＞0.05)。结果见表3。

表3 金水宝胶囊对肝纤维化大鼠模型TIMP-1的影响 (±s)

表3 金水宝胶囊对肝纤维化大鼠模型TIMP-1的影响 (±s)

注:与空白组对比，*P ＜0.05，□P ＞0.05;与模型组对比，﹟ P ＜0.05 ，△P ＞0.05。

组别 动物/只 TIMP-1/(ng/mL)空白对照组10 24.35 ±4.04模型对照组 11 33.45 ±7.79*金水宝胶囊小剂量治疗组 12 32.54 ±8.53＊△金水宝胶囊中剂量治疗组 12 24.79 ±4.53□﹟金水宝胶囊大剂量治疗组 12 24.21 ±5.44□﹟

5 讨论

肝纤维化是细胞外基质(ECM)合成、降解与沉积的不平衡，而引起的ECM过度沉积的病理过程，在这个过程中，基质金属蛋白酶-1(MMP-1)降解ECM，而TIMP-1可抑制MMP-1活性［4-5］。多项研究发现MMP-1与TIMP-1可有助于对肝纤维化的评价［6-7］，通过降低TIMP-1，可减少 MMP-1所受抑制，从而有利于ECM的降解，促进肝纤维化的逆转。

HA是由间质细胞合成的一种大分子葡萄胺多糖，在肝脏主要是由肝星状细胞合成，分布在各种结缔组织中，是ECM的重要成分之一。血清PC-III含量可反映III型胶原的代谢和肝纤维化程度，血清IV-C也与肝纤维化有相关性。血清HA、PC-Ⅲ、Ⅳ-C可从不同的角度反映肝纤维化的情况，HA、PC-Ⅲ较敏感［8-9］。

金博等［10］发现人工虫草菌丝可减少大鼠四氯化碳实验性肝纤维化肝内胶原的沉积。李风华等［11］经实验证明冬虫夏草菌丝有显著的抗肝纤维化作用，其机制与促进胶原降解有关。马雄等［12］实验后认为冬虫夏草多糖脂体能明显减少肝脏的胶原沉积，并能抑制I、III型前胶原基因的表达。

金水宝胶囊主要成分为蝙蝠蛾拟青霉Cs-4，是天然冬虫夏草的替代品，本次实验结果显示:金水宝胶囊可升高四氯化碳实验性肝纤维化大鼠模型ALB，降低 TIMP-1、HA、PC-III、IV-C，具有较好的抗实验性大鼠肝纤维化的作用。其可能的机理为通过抑制TIMP-1，减少对MMP-1降解ECM的干扰。因此，金水宝胶囊与天然冬虫夏草同样具有较好的抗肝纤维化的作用，有望应用于临床对肝纤维化的治疗。

［1］程明亮，刘三都主编.肝纤维化的基础研究和临床［M］.北京:人民卫生出版社，1996.

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