大孔树脂纯化野菊花总黄酮的工艺研究

程文明， 张 明， 李 俊， 戴 胜， 李 荣

(安徽医科大学药学院安徽天然药物活性研究省级重点实验室，安徽合肥230032)

野菊花为菊科植物野菊(Chrysanthemum indicum L.)的头状花序，其性凉，味苦、辛，归肺、肝经，具有清热解毒、消散痈肿、疏风平肝之功效，在我国的药用历史悠久［1］。野菊花主要含倍半萜类、黄酮类及挥发油，其中黄酮类成分具有多种生理活性［2-8］。本实验在前期研究基础上［9］，选取 10 种不同厂家，不同型号的大孔树脂，考察它们的吸附与解析性能，以总黄酮回收率为指标，以期选出对野菊花总黄酮具有较好吸附－解吸性能的大孔树脂，并优化其工艺参数。

1 仪器与试剂

试剂及药材:无水乙醇，三氯化铝，乙酸钠，所用试剂均为分析纯;木犀草素(批号:111520-200201，中国药品生物制品检定所)。AB-8树脂(分别购于天津光复精细化工研究所、西安蓝晓科技有限公司)，D101树脂、LX-60树脂、LX-38树脂均购自西安蓝晓科技有限公司，DA201树脂、DM301树脂、DM130树脂、ADS-17树脂、HDP-100均购自安徽三星树脂科技有限公司;野菊花药材购于安徽亳州市药材市场，由安徽医科大学药学院程文明副教授鉴定为菊科植物野菊(Chrysanthemum indicum L.)的头状花序。

仪器:BP211D电子天平(Sartarius)，KQ-500B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，WH-2振荡仪(江苏省兴化市分析仪器厂)，8453紫外分光光度计(Agilent)，RV10旋转蒸发仪(IKA)，EKS5AB电热真空干燥箱(上海申光仪器仪表有限公司)。

2 方法与结果

2.1 野菊花提取物的制备［9］称取野菊花干燥的药材粗粉100 g于2000 mL圆底烧瓶中，用10倍量80%乙醇回流提取2次，每次3 h，提取液合并，抽滤，减压浓缩，真空干燥，备用。

2.2 标准曲线的建立［9］精密称取木犀草素对照品2.00 mg于25 mL量瓶中，用70%乙醇溶解，定容，摇匀，制成质量浓度为0.080 mg/mL的木犀草素标准品溶液。分别精密吸取标准品溶液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 至 25 mL 量瓶中，加入1.0 mol/L 醋酸钠溶液 1.5 mL，0.1 mol/L三氯化铝溶液1 mL，用蒸馏水定容，摇匀，静置40 min，经紫外扫描，于410 nm处测定吸光度，以总黄酮质量浓度(mg/mL)对吸光度A进行线性回归，得回归方程为 C=0.0141A －0.00005(R2=0.9998)，线性范围为 0.0016 ～0.0193 mg/mL。

2.3 样品测定及样品溶液的制备 精确称取1.00 g野菊花提取物于250 mL量瓶中，用70%乙醇定容，摇匀，精确吸取溶液0.4 mL，按2.2项测定吸光度，计算野菊花提取物中总黄酮的平均质量分数为5.2%(n=3)。定量称取样品，加水溶解，超声促溶，过滤，作为上柱用样品溶液。

2.4 不同型号吸附树脂的筛选研究

2.4.1 静态吸附 －解吸性能考察试验［10］将已处理好的各种树脂中游离水分抽干，准确称取1.00 g，置50 mL锥形瓶中，加入样品溶液20 mL(野菊花总黄酮质量浓度1.8 mg/mL)，每隔5 min振摇10 s，持续2 h，使其充分吸附，抽滤。精确吸取滤液0.4 mL，按2.2项测定吸光度(A)，计算总黄酮剩余量和吸附量。

将各种树脂滤出后分别另置50 mL锥形瓶中，各加入90%乙醇20 mL，每隔5 min振摇10 s，持续2 h，使其充分解吸附，抽滤，得解吸后的滤液。分别精确量取3.0 mL解吸液，按2.2项测定并计算总黄酮的静态比吸附量、比解吸量及解吸率。每个实验条件，平行进行3次实验，结果见表1。

比吸附量=(初始质量浓度－剩余质量浓度)×溶液体积/干树脂质量

比解吸量=(解吸液质量浓度×解吸液体积)/干树脂质量

解吸率(%)=比解吸量/比吸附量×100%

表1 10种大孔树脂对总黄酮静态吸附行为影响(n=3)Tab.1 Static adsorption of total flavonoids by ten types of macroreticuler resins(n=3)

结果显示，静态吸附量高且解吸率在75%左右的5种树脂，分别是 AB-8(西安蓝晓)、DM301、DM130、LX-60 及 HDP-100。

2.5 动态吸附－解吸性能考察试验［10］称取各种树脂10 g分别装入同一规格的层析柱(2.0 cm×40 cm)，加入40 mL野菊花样品液(野菊花总黄酮质量浓度1.8 mg/mL)，动态吸附两次，静置12 h，至各树脂均达到吸附饱和，收集吸附后的样品液，用蒸馏水将未吸附样品液洗净，将样品液置于100 mL量瓶中，精确吸取溶液1 mL，按2.2项下方法操作，测定其剩余总黄酮量。

用90%乙醇洗脱，至洗脱液无色透明，将洗脱液减压浓缩置于100 mL量瓶中，精确吸取溶液3 mL，按2.2项下方法操作，测定其中的总黄酮量，每个实验条件，平行进行3次实验，结果见表2。

表2 10种大孔树脂对总黄酮动态吸附行为的影响(n=3)Tab.2 Dynamic adsorption of total flavonoids by ten types of macroreticuler resins(n=3)

综合树脂静态吸附和动态吸附试验，可知LX-60树脂对野菊花总黄酮显示较高的吸附及解吸性能。

2.6 LX-60大孔树脂纯化野菊花总黄酮的工艺参数考察

2.6.1 上样浓度对LX-60树脂纯化野菊花总黄酮的影响 精确称取不同质量的野菊花提取物用15%乙醇溶解，定容至50 mL。精确吸取4 mL样品液，按2.2项下方法操作，测定其中的总黄酮量。将46 mL样品液以2 BV/h上样速度上柱，重复吸附一次，吸附完全后，先用蒸馏水将未吸附样品液洗净，再用90%乙醇洗至洗脱液中基本无黄酮。将洗脱液浓缩定容至100 mL。精确吸取4 mL解吸液，按2.2项下方法操作，测定总黄酮量，计算其转移率，每个实验条件，平行进行3次实验，结果见表3。

表3 上样质量浓度对总黄酮的影响(n=3)Tab.3 Effect of sample concentration on total flavonoids(n=3)

由表3可知，LX-60树脂在低浓度时具有较高的转移率，质量浓度升高到1.6 mg/mL时，总黄酮转移率开始明显降低，故上样质量浓度选择1.6 mg/mL。

2.6.2 吸附体积流量对LX-60树脂纯化野菊花总黄酮的影响 取适量野菊花提取物，溶解定容至250 mL。精确吸取4 mL样品液，按2.2项下方法操作，测定其中的总黄酮含量。精确吸取40 mL样品液以不同上样速度上柱，重复吸附一次，吸附完全后，先用蒸馏水将未吸附样品液洗净，再用90%乙醇洗脱。将洗脱液浓缩定容至100 mL。精确吸取4 mL解吸液，按2.2项下方法操作，测定总黄酮量，计算其转移率，每个实验条件，平行进行3次实验，结果见表4。

表4 吸附体积流量对总黄酮的影响(n=3)Tab.4 Effect of adsorption rate on total flavonoids(n=3)

结果表明，吸附体积流量为1 BV/h时黄酮转移率最高，体积流量过快吸附可能不完全。为提高工作效率，确定吸附体积流量为2 BV/h。

2.6.3 吸附次数对LX-60树脂纯化野菊花总黄酮的影响 将野菊花提取物用15%乙醇溶解定容至250 mL。精确吸取4 mL样品液，按2.2项下方法操作，测定其中的总黄酮量。精确吸取40 mL样品液以2 BV/h上样体积流量上柱，以不同吸附次数，吸附完全后，先用蒸馏水将未吸附样品液洗净，再用90%乙醇洗脱。将洗脱液浓缩定容至100 mL。精确吸取4 mL解吸液，按2.2项下方法操作，测定总黄酮量，计算其转移率，每个实验条件，平行进行3次实验，结果见表5。

表5 吸附次数对总黄酮的影响(n=3)Tab.5 Effect of adsorption times on total flavonoids(n=3)

由表5可以看出，吸附2次时野菊花总黄酮的转移率较高。

2.6.4 吸附时间对LX-60树脂纯化野菊花总黄酮的影响 将野菊花提取物用15%乙醇溶解定容至250 mL。精确吸取4 mL样品液，按2.2项下方法操作，测定其中的总黄酮量。精确吸取40 mL样品液以2 BV/h上样体积流量上柱，重复吸附一次，分别静置吸附0.5、1、2、4 h 后，先用蒸馏水将未吸附样品液洗净，再用90%乙醇洗脱。将洗脱液浓缩定容至100 mL。精确吸取4 mL解吸液，按2.2项下方法操作，测定总黄酮量，计算其转移率，每个实验条件，平行进行3次实验，结果见表6。

表6 吸附时间对总黄酮的影响(n=3)Tab.6 Effect of adsorption time on total flavonoids(n=3)

由表6可知，较长吸附时间并未提高总黄酮的转移率，故静置0.5 h即可。

2.6.5 洗脱剂浓度对LX-60树脂纯化野菊花总黄酮的影响 取适量野菊花提取物，溶解定容至250 mL。精确吸取4 mL样品液，按2.2项下方法操作，测定其中的总黄酮量。精确吸取40 mL样品液以2 BV/h上样体积流量上柱，重复吸附一次，吸附完全后，先用蒸馏水将未吸附样品液洗净，再分别用不同浓度的乙醇洗脱至洗脱液中基本无黄酮。将洗脱液浓缩定容至100 mL。精确吸取4 mL解吸液，按2.2项下方法操作，测定总黄酮量，计算其转移率，每个实验条件，平行进行3次实验，结果见表7。

表7 洗脱剂质量分数对总黄酮的影响(n=3)Tab.7 Effect of concentration of eluent on total flavonoids(n=3)

由表7可知，在较高洗脱剂浓度下，野菊花总黄酮有较高的转移率，故选取90%乙醇为最佳洗脱剂浓度。

2.6.6 冲洗用水体积对LX-60树脂纯化野菊花总黄酮的影响 取适量野菊花提取物，溶解定容至250 mL。精确吸取4 mL样品液，按2.2项下方法操作，测定其中的总黄酮量。精确吸取40 mL样品液以2 BV/h上样体积流量上柱，重复吸附一次，吸附完全后，用不同体积的蒸馏水将未吸附样品液洗净，再用90%乙醇洗脱。将洗脱液浓缩定容至100 mL。精确吸取4 mL解吸液，按2.2项下方法操作，测定总黄酮量，计算其转移率，每个实验条件，平行进行3次实验，结果见表8。

表8 冲洗用水体积对总黄酮的影响(n=3)Tab.8 Effect of volume of washing water on total flavonoids(n=3)

由表8可知，用蒸馏水4 BV冲洗树脂，能够达到较高的转移率。

2.6.7 洗脱速度对LX-60树脂纯化野菊花总黄酮的影响 取适量野菊花提取物，溶解定容至250 mL。精确吸取4 mL样品液，按2.2项下方法操作，测定其中的总黄酮量。精确吸取40 mL样品液以2 BV/h上样体积流量上柱，重复吸附一次，吸附完全后，先用蒸馏水将未吸附样品液洗净，再分别用90%的乙醇以不同的洗脱速度洗脱。将洗脱液浓缩定容至100 mL。精确吸取4 mL解吸液，按2.2项下方法操作，测定总黄酮含量，计算其转移率，每个实验条件，平行进行3次实验，结果见表9。

表9 洗脱体积流量对总黄酮的影响(n=3)Tab.9 Effect of eluting rate on total flavonoids(n=3)

由表9可知，洗脱速度较慢时能将总黄酮转移较完全，因此，选取2 BV/h为最佳洗脱体积流量。

2.6.8 洗脱剂体积对LX-60树脂纯化野菊花总黄酮的影响 取适量野菊花提取物，溶解定容至250 mL。精确吸取4 mL样品液，按2.2项下方法操作，测定其中的总黄酮含量。精确吸取40 mL样品液以2 BV/h上样体积流量上柱，重复吸附一次，吸附完全后，用蒸馏水将未吸附样品液洗净，再用不同体积的90%乙醇洗脱。将洗脱液浓缩定容至100 mL。精确吸取4 mL解吸液，按2.2项下方法操作，测定总黄酮量，计算其转移率，每个实验条件，平行进行3次实验，结果见表10。

表10 洗脱剂体积对总黄酮的影响(n=3)Tab.10 Effect of volume of eluent on total flavonoids(n=3)

由表10可知，4 BV洗脱剂就可以将总黄酮较完全地被洗脱下来。

2.6.9 树脂柱径高比对LX-60树脂纯化野菊花总黄酮的影响 取适量野菊花提取物，溶解定容至250 mL。精确吸取4 mL样品液，按2.2项下方法操作，测定其中的总黄酮含量。精确吸取50 mL样品液以2 BV/h上样体积流量上于不同径高比(1∶2;1∶6;1∶20)的层析柱，重复吸附一次，吸附完全后，用蒸馏水将未吸附样品液洗净，再用不同体积的90%乙醇洗脱。将洗脱液浓缩定容至100 mL。精确吸取4 mL解吸液，按2.2项下方法操作，测定总黄酮量，计算其转移率，每个实验条件，平行进行3次实验，结果见表11。

表11 径高比对总黄酮影响(n=3)Tab.11 Effect of diameter height ratio of column on total flavonoids(n=3)

由表11可知，树脂柱过短使得总黄酮转移率偏低，径高比达1∶6时，黄酮转移率较高。

2.6.10 树脂重复使用次数对LX-60树脂纯化野菊花总黄酮的影响 取适量野菊花提取物，溶解定容至250 mL。精确吸取4 mL样品液，按2.2项下方法操作，测定其中的总黄酮量。精确吸取40 mL样品液以2 BV/h上柱，重复吸附一次，吸附完全后，用蒸馏水将未吸附样品液洗净，再用不同体积的90%乙醇洗脱。按将洗脱液浓缩定容至100 mL。按此方法重复5次。精确吸取4 mL解吸液，按2.2项下方法操作，测定总黄酮量，计算其转移率，每个实验条件，平行进行3次实验，结果见表12。

表12 树脂重复使用次数对总黄酮的影响(n=3)Tab.12 Effect of resin repeated adsorptions on total flavonoids(n=3)

由表12可知，重复使用次数增加到5次时，黄酮转移率明显降低，故LX-60树脂纯化野菊花总黄酮可重复使用4次。

2.6.11 泄漏曲线的绘制 将质量浓度为2.0 mg/mL的样品液加入已预处理好的LX-60树脂(10 g)，进行动态吸附。控制体积流量为2 BV/h，每10 mL为一流分。当树脂不再吸附总黄酮时，停止上样，记录上样量，精确吸取2 mL解吸液，按2.2项下方法操作，测定各流分中野菊花总黄酮A值，绘制泄漏曲线，结果见图1。

图1 总黄酮泄漏曲线Fig.1 Leakage curve of total flavonoids

由泄漏曲线可以看出，在上样体积达到240 mL时，黄酮已经出现明显泄漏。因此，树脂对黄酮最大上样量为48 mg/g干树脂。

2.6.12 洗脱曲线的绘制 取适量野菊花提取物，溶解定容至250 mL。精确吸取40 mL样品液以2 BV/h上树脂柱(1BV=10 mL)，重复吸附一次，吸附完全后，用蒸馏水将未吸附样品液洗净，再用90%乙醇洗脱，每10 mL为一流分，至洗脱液基本无黄酮时停止。精确吸取4 mL解吸液，按2.2项下方法操作，测定各流份中总黄酮A值，绘制洗脱曲线，结果见图2。

图2 总黄酮洗脱曲线Fig.2 Elution curve of total flavonoids

由洗脱曲线可以看出，在洗脱至40 mL(4 BV)洗脱剂时，黄酮含量已经很低，表明此时洗脱已经较完全。

2.7 验证试验 取适量野菊花提取物，溶解定容至250 mL。精确吸取4 mL样品液，按2.2项下方法操作，测定其中的总黄酮量。精确吸取40 mL样品液，以2 BV/h加入LX-60大孔树脂(10 g)中，重复吸附一次，吸附完全后，用蒸馏水将未吸附样品液洗净，再用90%乙醇洗脱完全。将洗脱液浓缩并定容至100 mL。精确吸取4 mL解吸液，按2.2项下方法操作，测定并计算总黄酮转移率及纯度，每个实验条件，平行进行3次实验，结果表明，LX-60树脂对野菊花总黄酮的转移率可达到92.3%(n=3)，总黄酮纯度为34.3%(n=3)，比提取物提高了6.6倍，说明LX-60树脂对野菊花总黄酮具有良好的纯化作用。

3 讨论

3.1 据报道，部分结构黄酮在NaOH中稳定性差，故本实验采用NaAc-AlCl3体系测定野菊花总黄酮的量［11-12］。本实验采用木犀草素为对照品，以NaAc-AlCl3显色，通过紫外扫描，发现在410 nm处有最大吸收，此处杂质无干扰，对照品及样品在显色后40 min内稳定。

3.2 本实验所选大孔树脂有非极性(D101，LX-60，HDP-100)，弱、中极性(AB-8，LX-38，DM130;ADS-17，DM301)、极性(DA201)之分。通过对10种树脂的静态及动态吸附－解吸性能比较，结果表明LX-60型大孔吸附树脂用于富集野菊花总黄酮，不仅吸附容量较大，洗脱率较高，而且树脂性能稳定，可重复使用。LX-60树脂纯化野菊花总黄酮的优化工艺为:层析柱径高比为1∶6，上样质量浓度1.6 mg/mL，吸附速度2 BV/h，最大上样量48 mg/g干树脂，重复吸附2次，冲洗用蒸馏水用量4 BV，洗脱剂为90%乙醇，解吸速度2 BV/h，洗脱剂用量4 BV。通过验证试验表明，此方法对野菊花总黄酮具有良好的纯化作用。

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