两种常用膜对地龙匀浆液有效成分分级分离效果的比较

戴启刚， 詹秀琴

(1.南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京210046;2.南京中医药大学基础医学院，江苏 南京210046)

现代膜分离技术(membrane separation technology，MST)以选择性透过膜为分离介质，以膜孔径大小为特征，在推动力(如压力差、浓度差、电位差等)驱使下，原料侧组分选择性地通过膜，以达到分离、提纯的目的［1］，其产物或是单一成分，或是某一分子量区段的多种成分，能有效地分离提纯同一活性组分群。因其具有节能、高效、无相变化、操作方便、无二次污染、操作温度低等优点，在中药尤其是主要活性成分为热敏性蛋白的动物药的分离纯化中有广泛的应用前景。MST所用膜有多种材质，在中药有效成分分离中常用膜材料主要是无机膜、高分子有机膜(如聚偏氟乙烯 polyvinylidenefluoride，PVDF)［2］。其中PVDF是一种新兴的、综合性能优良的膜材料，机械强度高，耐酸碱等苛刻环境条件和化学稳定性好，是超滤和微滤的常用膜材料;而无机陶瓷膜具有优异的化学稳定性和良好的机械强度，在中药体系的应用中突出优点在于其抗污染性能强，对药液的前处理要求不高，膜可以反复再生，操作过程稳定，常用的是三氧化二铝(Al2O3)和氧化锆(ZrO2)膜管。

现代药理研究发现［3］，动物药地龙(Pheretima)活性成分多元化，具有抗凝、溶栓、抑制血小板聚集、抗癌、平喘、抗氧化等活性作用。本实验根据动物类中药地龙的主要有效成分为蛋白多肽类物质，如蚯蚓纤溶酶、蚓激酶等，分子量多在10000～100000之间，且其分子量分布与药效作用有密切相关性的基本原理，选择PVDF、无机Al2O3及ZrO2陶瓷膜管对地龙匀浆液有效组分进行分级分离提纯，精制出多个具有不同分子量分布特征的地龙活性组分群，根据所测各分离液中活性组分的蛋白含量、分子量分布、纤溶活性，比较两种膜分离提纯地龙匀浆液有效组分的优劣，为大规模工业化生产分离提纯地龙匀浆液有效组分提供技术支持。

1 实验材料和设备

1.1 实验材料 鲜地龙:品种为赤子爱胜蚓(Eisenia foetide)，购于南京农业大学养殖场;考马斯亮蓝G-250、R-250(美国 AMRESCO公司生产，进口分装);牛血清白蛋白(BSA)、低分子量标准蛋白质(为6种蛋白质的混合体，分别为卵清溶菌酶14400、胰蛋白酶抑制剂20100、牛碳酸酐酶31000、兔肌动蛋白酶43000、牛血清清蛋白66200、兔磷酸化酶97400)(上海伯奥生物科技有限公司产品);牛纤维蛋白原、凝血酶原、纤溶酶原、尿激酶均购于江苏省药品生物制品检验所;琼脂糖(BDH进口分装);其他试剂均为国产或者Sigma分析纯。

聚偏氟乙烯膜(PVDF):截留分子量(MWCO)为 10000、50000、100000，购于上海应用物理研究所;膜管:0.2 μm Al2O3、50 nm ZrO2无机陶瓷膜管，均购于南京工业大学膜科学技术研究所，所有膜管外径12 mm，内径8 mm，长20 cm，有效滤过面积为0.005 m2。

1.2 实验仪器设备 XHF-1内切式匀浆器，购于浙江宁波新芝科学仪器研究所;台式高速冷冻离心机:TGL-16M型，长沙湘仪离心机仪器有限公司生产;DYY-Ⅲ713型电泳槽、DYY-4型稳压稳流电泳仪、WD-9405B型脱色摇床，均购自北京六一仪器厂;37℃恒温水浴箱;打孔器;玻璃平板(9 cm×9 cm);721分光光度计，上海分析仪器厂生产;37度恒温水浴锅;台式离心机;微量式移液枪。

SCM超滤杯:膜有效过滤面积为3.32×10－3m2，购于上海应用物理研究所新技术中心;微型无机陶瓷微滤膜装置，南京化工大学膜科学技术研究所研制。实验装置如图1。

图1 实验装置流程图Fig.1 Experimental process diagram

2 实验方法

2.1 过膜操作 取一定量的地龙，加入3倍量的二次蒸馏水，匀浆10 min，11000 r/min ×20 min、10 ℃离心，取地龙上清液置于4℃冰箱冷藏备用。

SCM超滤杯过膜分离过程:取100 mL地龙上清液，在最优操作条件下即 0.25 MPa，30 °C，200 r/min，pH 为 6.7，地龙浓度为 33.3%(w:w)(本课题组已发表相关论文［4］)依次过膜材料孔径(MWCO)为100000、50000、10000超滤膜进行分级过滤。即上清液先用MWCO 100000超滤膜进行过滤，当滤过液为80 mL时，往杯内截留液中加入10 mL双蒸水，继续超滤，至滤过液体积为约100 mL时停止。截留液保留备用，100 mL滤过液在清洗超滤杯后用MWCO 50000超滤膜进行过膜分离。依法分离，收集每一级滤过液和截留液，备用。

无机陶瓷微滤膜膜分离过程:取一定量地龙上清液，在0.15 MPa，50 ℃，33.3%的最佳操作条件下(本课题组已发表相关论文［5］)先后用 0.2 μm Al2O3、50 nm ZrO2无机陶瓷膜管对地龙匀浆液进行分级分离，方法如PVDF膜分离，收集每一级的滤过液和截留液，备用。

2.2 蛋白浓度的测定 采用考马斯亮蓝结合法测定各级滤过液和截留液蛋白质的量。按照文献［6］方法，以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白质，用0.15 mol/L NaCl将其做梯度稀释成 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 液，加入考马斯亮蓝G-250，在595 nm处读取吸光值，绘制标准曲线，将样品的吸光值与标准曲线比较，即可计算出样品的蛋白浓度。

2.3 分子量分布测定 采用十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定样品中活性蛋白的分子量范围和量大小。按照文献［7］方法，采用5%浓缩胶、12%分离胶。

2.4 纤溶活性检测 按Astrup法［8］制备纤维蛋白平板:将平板(9 cm×9 cm)放在水平仪上调至水平，用1倍pH7.2 PBS溶液配制1%的琼脂糖，取5 mL 65℃恒温，另取等体积缓冲液5 mL，在37℃恒温箱中保温，加入1/4支纤维蛋白原和10U凝血酶，终质量浓度为3 mg/mL，两种溶液迅速混匀，趁热倒入平板中，将气泡赶至边缘，室温下凝固，用外径6 mm的打孔器打孔(数目按需要定)。分别在孔中加入20 μL不同浓度的尿激酶、待测样品，37℃恒温水浴5 h后测溶圈两相互垂直的直径。重复3次。

3 实验结果及讨论

3.1 蛋白浓度的测定

3.1.1 标准曲线的绘制 据表1的数据以标准蛋白浓度为横坐标、OD595nm值为纵坐标作标准曲线。

表1 标准蛋白牛血清白蛋白OD595 nm值Tab.1 OD595 nmof standard protein BSA

分析标准曲线可知，蛋白量与光密度成线性关系，OD595nm值=0.56×标准蛋白BSA浓度，可根据光密度计算出样品的蛋白量。

3.1.2 各样品中的蛋白量及讨论 根据光密度值，测定膜分级过滤所得滤液蛋白量变化如表2及蛋白浓度见表3。

表2 过膜前后蛋白量变化Tab.2 Change of protein level after membrane separation

表3 样品液蛋白质量浓度(mg/mL)Tab.3 Concentration of protein in sample solution(mg/mL)

由表2、3可见，PVDF10万膜截留前后液中蛋白浓度相差不大，且膜蛋白截留率较小，能将大分子蛋白截留，允许小分子蛋白通过，因此有利于后面的分级分离;5万膜二级分离时截留液中蛋白量远高于滤过液，截留率高，说明其截留效果最好，能制备高浓度的地龙蛋白液，但同时又会因蛋白吸附在膜表面形成滤饼层及膜孔阻塞造成膜污染严重，把分子量小于50000的蛋白质也截留了下来;1万膜的截留率小，这是因为三级分离时，液体中的蛋白质量已减少，且大多数是分子量较小的蛋白和多肽，蛋白质通过率高，但对分子量10000的蛋白质能有效截留纯化。

图2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳Fig.2 SDS-PAGE of Samples

无机陶瓷膜用0.2 μm Al2O3管分离时，截留液和滤过液中的蛋白含量相差很大，膜的截留率为49.3%，且蛋白丢失率达48.7%。无机膜二级分离用50 nm ZrO2膜管，截留液和滤过液中的蛋白量存在差别，且膜的截留率高、蛋白丢失率小，这说明经一级Al2O3膜管处理后的液体再用ZrO2膜管，能将活性蛋白截留浓缩，另外该级膜分离时蛋白质丢失少。

3.2 分子量分布测定 图2A中可见10万膜截留液中对应位置在26000以上的蛋白条带和匀浆液几乎一致但条带浅，说明它能允许较多的小分子蛋白通过膜。而5万膜截留液中蛋白量大且种类多，能将较多蛋白截留浓缩。1万膜截留液中分子量在31000以下有一条带，说明其对这一分子量的蛋白质能有效截留。

图2B中发现，地龙匀浆液主要活性蛋白分子量分布在 10000 ～100000。匀浆液、0.2 μm Al2O3截留液的蛋白条带所处位置几乎一致，但后者蛋白条带染色深，蛋白量大，这说明0.2 μm Al2O3管能将匀浆液中的蛋白有效截留浓缩，分子量在26000左右的含量尤其高，26000以下分子量的蛋白比较少，说明其截留的主要是分子量不小于26000的蛋白质。50 nm ZrO2滤过液中分子量在20100以下的蛋白量较高。这说明用无机膜分离地龙匀浆液精制活性成分，一级0.2 μm Al2O3膜管纯化效果差，但用二级膜管分离可以得到某一分子量范围的活性组分群。

3.3 纤溶活性测定

3.3.1 标准曲线的测定 用20 μL浓度分别为20、40、60、80、100 U/mL 的尿激酶点样，测定溶圈的两个互相垂直的直径，两直径乘积减去孔直径(6 mm)平方即为溶圈面积，以尿激酶浓度为横坐标、溶圈面积为纵坐标作标准曲线。

结果见表4。

表4 尿激酶纤溶活性测定Tab.4 Determination of fibrinolytic activity of urokinase

分析标准曲线可知，溶圈面积=－35.56+1.75×尿激酶浓度。表明当尿激酶浓度大于20 U/mL时，溶圈面积和尿激酶的浓度成线性关系。本方法灵敏可靠，可以通过比较溶圈面积的大小来判定纤溶作用的强弱。

3.3.2 分级分离样品的纤溶活性测定 分别将膜分离的样品点样在纤维蛋白平板孔中，测定溶圈的两个互相垂直的直径，并计算两者的乘积，两者的乘积减去孔直径平方即为溶圈的面积，可用来反映样品的纤溶活性。结果见图3、表5。

从表中可以看出，PVDF 5万膜截留液的蛋白量最多，溶圈面积最大，说明5万膜基本上能将有纤溶活性的蛋白质截留浓缩，有利于对地龙匀浆液有效成分的分离;10万膜分离时，截留液和滤过液蛋白量、溶圈面积差别不大;而用无机陶瓷膜0.2 μm Al2O3分离，则蛋白量低，溶圈面积小，纤溶活性小。至于PVDF 1万膜和50 nm ZrO2二级无机膜滤过刚截留液和滤过液同样存在着蛋白量低，溶圈面积小，纤溶活性低，不利于得到高浓度高纤溶活性的蛋白截留提纯物。

图3 膜分离物的纤溶活性Fig.3 Fibrinolytic activity determination of products of membrane separation

表5 分离物的纤溶活性测定Tab.5 Fibrinolytic activity determination of products of membrane separation

4 结论

通过对地龙分级分离物的蛋白含量测定、分子量分布测定、纤溶活性测定，结果显示:有机膜PVDF对地龙匀浆液的分离纯化效果较好，MWCO 50，000膜分离能得到具有较大纤溶活性蛋白组分群;无机0.2 μm Al2O3陶瓷膜不适合分离蛋白量较多的地龙匀浆液，但50 nm ZrO2能对经过0.2 μm Al2O3处理的滤过液进行一定程度的有效分离纯化。因此，PVDF可用来对地龙匀浆液分离纯化，其效果好于无机陶瓷膜。

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