HPLC法测定苦参软膏中苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱

毛 丹， 陈 钶， 王 柯， 季 申

(上海市食品药品检验所，上海201203)

苦参软膏主要含苦参总碱，具有抗菌消炎作用，主要用于治疗宫颈糜烂、赤白带下、滴虫性阴道炎及阴道霉菌感染等妇科慢性炎症。原质量标准是采用酸碱滴定法［1］测定总生物碱的量，操作繁琐，专属性差。苦参总碱中含有苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱，是苦参总碱的主要活性成分。为有效控制药品质量，本实验采用反相高效液相色谱法［2-8］同时测定苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱的量，为质量标准的提高和修订提供依据。

1 仪器与材料

Agilent 1100高效液相色谱仪，紫外-可见光检测器，Chemstation色谱工作站。苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱对照品均由中国药品生物制品检定所提供，批号分别为 805-200005、110784-200303、0780-200004。样品:苦参软膏样品(批号为20100802，20100803，20100804)及阴性样品均由上海宝龙药业有限公司提供。乙腈为色谱纯(Merck公司)，其余试剂均为分析纯，由中国医药(集团)上海化学试剂公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Inertsil ODS-3柱(5 μm，0.46 cm ×15 cm)，流动相为乙腈 －0.1%磷酸溶液(18 ∶82，v/v)(三乙胺调节 pH 值至 8.0)，体积流量:1.0 mL/min，检测波长:220 nm，柱温:30 ℃，进样量:5 μL。在上述色谱条件下，苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱的理论板数均不低于4000，苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，对称因子在0.95～1.05之间。阴性对照溶液对样品测定无干扰。结果见图1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱对照品适量，分别加流动相制成每1 mL 含苦参碱1.952 mg、槐定碱2.49 mg、氧化苦参碱1.002 mg的对照品溶液;精密吸取上述苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱对照品溶液各1 mL、1 mL和0.5 mL，混合，摇匀，作为对照品溶液①;另精密吸取上述苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱对照品溶液各1 mL、1 mL 和 0.5 mL，置 10 mL 量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为对照品溶液②;再精密吸取对照品溶液②2 mL，置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为对照品溶液③。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液1 mL，精密加入三氯甲烷20 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率140 W，频率42 kHz)30 min，放冷，离心，取上清液5 mL，减压回收至干，残渣加流动相溶解并转移至5 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 取按处方除去苦参总碱的阴性样品，按2.2.2项下的制备方法制成阴性对照溶液。

2.3 线性关系考察 精密吸取上述对照品溶液③2 μL，对照品溶液②1 μL、2 μL、5 μL，对照品溶液①2 μL、5 μL、10 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，回归方程分别为:苦参碱Y=1059X+4.875，r=0.9999(n=7);槐定碱 Y=662.03X －1.311，r=0.9999(n=7);氧化苦参碱 Y=872.38X+0.633，r=0.9999(n=7);结果表明，苦参碱在进样量为 0.07808 ～7.808 μg、槐定碱在进样量为 0.0996 ～9.96 μg、氧化苦参碱在进样量为0.02004 ～2.004 μg 范围内峰面积与进样量线性关系良好。

2.4 精密度试验 精密吸取上述对照品溶液②，按上述色谱条件连续进样6次，测定，计算苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱色谱峰面积的RSD分别为1.6%、1.1%和1.1%，结果表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验 吸取同一供试品溶液，在上述色谱条件下，分别于 0、4、9、14、21、25 h 进样测定，测得苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱色谱峰面积的RSD分别为1.5%、0.49%和2.1%，结果表明供试品溶液在25 h内基本稳定。

2.6 重复性试验 取同一批样品6份，分别按2.2.2项下的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱质量分数的RSD分别为1.7%、1.2%和2.5%，结果表明样品重复性良好。

2.7 加样回收率试验 取9个具塞锥形瓶，分别精密加入对照品溶液(苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱质量浓度分别为 1.839 mg/mL、2.419 mg/mL、0.539 mg/mL，均用无水乙醇溶解)0.8 mL、1 mL 和1.2 mL，一式9份，以3份为一组，减压回收至干，再取已测定的同一批样品9份(含苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱分别为 18.0 mg/g、23.0 mg/g、3.3 mg/g)，精密称定，置上述具塞锥形瓶中，按供试品溶液方法制备供试液，测定，结果见表1。

表1 苦参软膏中苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱加样回收率试验结果(n=9)Tab.1 Recoveries of matrine，sophoridine and oxymatrine in Kushen Ointment(n=9)

2.8 样品测定 按2.2.2项下供试品溶液的制备方法和测定条件，取2.2.1项下对照品溶液②作为对照品溶液，对3批样品中苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱进行测定，用外标法计算，结果见表2。

表2 苦参软膏中苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱测定结果(n=3)Tab.2 Content of matrine，sophoridine and oxymatrine in Kushen Ointment(n=3)

3 讨论

3.1 检测波长的选择 取苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱混合对照品溶液经二极管阵列检测器进行紫外光谱扫描，结果分别在204 nm、202 nm、202 nm处有最大吸收［9］，但在220 nm波长下，干扰少，基线稳定，重现性好，而且吸收度合适，故选择220 nm作为检测波长［10］。

3.2 流动相和色谱柱的选择 参照中国药典2010年版一部“苦参”项下方法［11］188，以氨基键合硅胶为填充剂，以乙腈－无水乙醇－3%磷酸溶液(80∶10∶10)为流动相［12］，结果得到的供试品色谱图中，苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱色谱峰不对称，且槐定碱与氧化苦参碱色谱峰的分离度稍差;又参照中国药典2010年版一部“消银片”项下方法［11］1038，采用Inertsil ODS-3 的色谱柱(5 μm，0.46 cm ×15 cm)，以乙腈－0.1%磷酸溶液(18∶82)(三乙胺调节pH值至8.0)为流动相［13］，结果得到的供试品色谱图中，苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱色谱峰较对称，且与其他色谱峰均分离良好，故选择该色谱柱与流动相系统进行检测。

3.3 供试品溶液制备方法的选择 苦参总碱中主要含有生物碱类成分，供试品溶液制备方法采用加浓氨试液使生物碱游离后加有机溶剂提取的方法［14］。为有效提取出苦参软膏中的生物碱类成分，对供试品溶液制备方法中浓氨试液的加入量、提取溶剂、提取方式等分别进行了考察。试验中对提取溶剂进行选择时，分别筛选了二氯甲烷、三氯甲烷和乙醚3种试剂，结果发现用三氯甲烷超声处理提取效率最高，故采用三氯甲烷作为提取溶剂。浓缩方式分别采用蒸干、减压回收至干2种进行比较，结果表明，蒸干会导致所测定成分的含量偏低，故选择减压回收至干作为样品的浓缩方式。同时我们在试验时还发现，使用无水乙醇配制的对照品溶液和供试品溶液的高效液相色谱图中溶剂峰对所测定的成分有干扰，故选择用流动相制备对照品溶液和供试品溶液。通过对供试品溶液的提取方法等进行考察，最终确定了前述提取方法。

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