GC法同时测定牵牛子脂肪油中5种脂肪酸

范鑫歆， 毕开顺， 马 超， 鲁雪峰， 陈晓辉

(沈阳药科大学，辽宁沈阳110016)

牵牛子为旋花科植物裂叶牵牛Pharbitis nil(L.)Choisy或圆叶牵牛 P.purpurea(L.)Voigt的干燥成熟种子，收载于2010版《中国药典》。具有泻水通便，消痰涤饮，杀虫攻积等作用。用于水肿涨满、二便不通、痰饮积聚、气逆喘咳和虫积腹痛等［1］。牵牛子脂肪油为淡黄色或黄色的澄明油状液体，味淡，无臭，为牵牛子中有效成分，含有量较大。近年来，仅有气-质联用法对牵牛子脂肪油中成分进行鉴定的报道［2］，但未见对其成分进行定量测定的报道。本实验对牵牛子脂肪油中5种脂肪酸测定方法进行了研究［3-10］，以期为控制牵牛子脂肪油的质量提供依据。

1 仪器与试药

Agilent 6890A毛细管气相色谱仪，Agilent 2000色谱工作站，氢火焰离子化检测器(FID)，AGBP210S电子分析天平(Sartorius公司)。棕榈酸甲酯(批号:18824)、硬脂酸甲酯(批号:13450)、油酸甲酯(批号:18834)、亚油酸甲酯(批号:20040)、亚麻酸甲酯(批号:20196)、豆蔻酸甲酯(批号:14337)均由北京百灵威化学试剂有限公司提供，纯度均大于99%。石油醚、正己烷和无水硫酸钠等均为分析纯，购自天津大茂化学试剂厂。牵牛子药材共10批，产地分别为浙江，江苏，上海，黑龙江，河北，辽宁，四川，吉林，天津，山东等，经沈阳药科大学孙启时教授鉴定为旋花科植物裂叶牵牛Pharbitis nil(L.)Choisy的干燥成熟种子。

2 方法与结果

2.1 脂肪油的提取 将不同产地的样品粉碎，过40目筛，取约10 g，精密称定，置500 mL圆底烧瓶中，加入石油醚70 mL，回流提取10 h，滤过，减压回收石油醚得总脂肪油。计算得油率，结果浙江，江苏，上海，黑龙江，河北，辽宁，四川，吉林，天津，山东分别为 6.7%，20%，16.7%，17.0%，15.6%，9.5%，10.5%，13.3%，15.6%，12.9%。

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别取对照品棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯适量，精密称定，置10 mL量瓶中，用正己烷稀释至刻度，制成质量浓度分别为 5.95、5.52、5.48、6.44、4.52 mg/mL的对照品溶液。分别精密吸取棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯对照品溶液 3、1、2、4、0.4 mL 置同一 25 mL量瓶中，用正己烷稀释至刻度，得到混合对照品溶液。

2.2.2 内标溶液 精密称取豆蔻酸甲酯适量，置25 mL量瓶中，用正己烷溶解并稀释至刻度，制成质量浓度为0.52 mg/mL的内标溶液。

2.2.3 供试品溶液 取脂肪油约100 mg，精密称定，置50 mL圆底烧瓶中，加入0.5 mol/L的氢氧化钠甲醇溶液5 mL，置60℃水浴回流皂化30 min，至油珠全部消失，放冷，加15%三氟化硼乙醚的甲醇溶液2 mL，置60℃水浴酯化5 min，放冷，精密加入正己烷5 mL，超声2 min，取出，置于分液漏斗中，加饱和氯化钠溶液10 mL，振摇，静置，取上层溶液，加无水硫酸钠干燥，再精密量取干燥后的溶液1 mL置10 mL量瓶中，加入内标溶液0.5 mL，用正己烷稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 色谱条件与系统适用性试验 DB-Wax毛细管柱(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);氢火焰离子化检测器(FID);进样口温度230℃;检测器温度250℃;柱温以170℃为起始温度，以10℃/min升至230 ℃，保持5 min;载气N2，体积流量1.0 mL/min;进样方式为分流进样，分流比15∶1;进样量1 μL。在上述色谱条件下，理论塔板数按亚油酸计算大于1.0×105，各峰与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，各峰拖尾因子均在0.95～1.05之间。对照品和样品色谱图见图1。

图1 对照品(A)和样品(B)色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of reference substance(A)and sample(B)

2.4 线性范围考察 分别精密吸取混合对照品溶液0.5、1、2、4、6、8 mL 置10 mL 量瓶中，分别精密加入内标溶液0.5 mL，用正己烷稀释至刻度，摇匀，在上述色谱条件下测定。以各对照品溶液质量浓度(X，mg/mL)为横坐标，以对照品与内标峰面积的比值(Y)为纵坐标，绘制标准工作曲线。棕榈酸甲酯，硬脂酸甲酯，油酸甲酯，亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯回归曲线方程分别为:Y=26.87X+1.830 ×10－2，r=0.9996;Y=21.98X+8.60 × 10－3，r=0.9996;Y=24.64X+2.030 × 10－2，r=0.9998;Y=22.86X+3.260 × 10－2，r=0.9997;Y=23.54X+5.200 ×10－3，r=0.9994。棕榈酸甲酯，硬脂酸甲酯，油酸甲酯，亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯分别在0.04～0.57 mg/mL，0.01 ～ 0.18 mg/mL，0.02 ～ 0.35 mg/mL，0.05 ～0.82 mg/mL，0.004 ～ 0.06 mg/mL 范围内，与内标峰面积比值呈良好线性关系。

2.5 精密度试验 取混合对照品溶液在上述色谱条件下连续进样6次，以棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯与内标峰面积比值计算 RSD，结果分别为 0.9%，1.1%，1.4%，1.0%，1.5%。

2.6 重复性试验 取同一批号药材(江苏)6份，按2.1项及2.2.3项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定，棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸含量的 RSD 分别为 1.3%，1.6%，1.5%，1.6%，2.0%。

2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，室温放置，于 0、2、4、6、8、10、12、24 h 分别进样分析，计算棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯各时间点峰面积与内标峰面积比值的RSD分别为 1.0%，1.4%，1.5%，1.2%，1.9%。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 回收率试验 称取已知量的同一批号牵牛子脂肪油(江苏)约50 mg，共9份，按低、中、高浓度分别加入各对照品贮备液，每一浓度3份。按照2.2.3项下方法操作制备供试溶液，在上述色谱条件下进样，计算回收率，结果见表1。

2.9 样品测定 取不同产地牵牛子脂肪油约100 mg，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，并在上述色谱条件下测定，按内标法计算，结果见表2。

3 讨论

3.1 色谱柱的选择 本研究考察了 DB-17，DBWax 3种不同型号的石英毛细管柱，结果表明DBWax石英毛细管柱能够使待测脂肪酸组分具有良好的分离和合适的保留时间。

表1 回收率试验结果(n=9)Tab.1 Results of recovery tests(n=9)

表2 牵牛子油测定结果(n=3)Tab.2 Determination results of fatty acid in seed of Pharbitis nil(L.)Choisy

3.2 柱温的考察 曾尝试200℃恒温测定，结果分析时间较长，且拖尾严重。尝试170～230℃程序升温的方式，色谱峰分离度好，且峰型良好，因此确定程序升温条件为初始温度170℃，以10℃/min升温，升至230℃。

3.3 提取方法的考察 研究中以石油醚(60～90℃)为提取溶剂，对索氏提取8 h和回流提取8 h，分别进行了考察，结果证明两种方法的提取率差别不大，因此选用较为方便的回流提取法。在此基础上对不同的提取时间(6，8，10，12 h)进行了考察，结果表明提取10 h与提取12 h牵牛子脂肪油的提取率基本一致，故确定提取时间为10 h。

本实验对10批样品测定的结果表明，不同产地的牵牛子脂肪油中棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸各成分质量分数最低和最高相差5倍左右，这可能与生长环境、干燥方法和贮存时间不同有关。测定结果表明牵牛子脂肪油中亚油酸量最高，占总油的34.6%，亚油酸具有降低血液中胆固醇的浓度，减少胆固醇在血管壁沉积的生理活性［11-13］。因此，牵牛子脂肪油的药用资源有待于进一步的开发与利用，本研究为牵牛子脂肪油的进一步临床应用价值和质量控制提供了依据。

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