伪品人工牛黄中染色物质的鉴定

楚 亮， 周 娟， 王 颖， 伍丕娥， 黎跃成

(四川省食品药品检验所，四川成都610097)

人工牛黄收载于中国药典2010年版一部，为批准文号管理，由牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、牛磺酸、胆红素、胆固醇、微量元素等组成，具有清热，解毒，化痰，定惊的作用［1］。由于天然牛黄资源稀缺，价格昂贵［2］，人工牛黄为国内大多数生产含牛黄制剂的厂家广泛使用。当前中药掺伪的现象时有发生，不法分子对一些资源少，价格高的药材通过染色来改善药材外观［3］，以次充好，谋取利益。本实验对伪品人工牛黄中添加的非法染色物质进行鉴定，并建立相关检测方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪，DAD检测器;Agilent 6210 TOF/MS质谱仪。

1.2 试剂 乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

1.3 对照品 胭脂红(批号111771-200701)、金橙Ⅱ(批号 111769-200701)、金胺 O(批号 111770-200701)、酸性红73(批号111773-200701)、赤藓红(批号111772-200701)，均购自中国药品生物制品检定所。

1.4 化工染料 日落黄、新红、诱惑红、808猩红、Scarlet等购于化工商店。

1.5 药材样品 伪品人工牛黄9批。

2 方法与结果

2.1 伪品人工牛黄中染色物质的薄层色谱检查

2.1.1 对照品溶液的制备 取胭脂红、日落黄、金橙Ⅱ、新红、诱惑红、金胺 O、scarlet、酸性红73、赤藓红、808猩红对照品及化工染料，分别加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取9批伪品人工牛黄样品各0.5 g，加甲醇 10 mL，超声处理 20 min，滤过，滤液作为供试品溶液。

2.1.3 试验方法 吸取上述溶液各5～10 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-氨水-水(1∶3∶3∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，日光下检视。

2.1.4 结果 5批伪品人工牛黄 B-1、Y-4、Y-5、B-3、H-4检出与金胺O对应的黄色斑点并且可能含有scarlet或酸性红73;1批伪品人工牛黄Y-2检出与金胺O对应的黄色斑点、与金橙Ⅱ对应的橙色斑点、与胭脂红对应的红色斑点;1批伪品人工牛黄Y-6检出与金胺O和胭脂红对应的颜色斑点;2批伪品人工牛黄H-6、B-4检出与金橙Ⅱ对应的颜色斑点，结果见图1。

2.2 伪品人工牛黄中染色物质的HPLC-DAD验证

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Lichrospher C18柱(5 μm，4.6 mm × 250 mm)。以甲醇为流动相 A，以0.005 mol/L醋酸铵为流动相B，按表1梯度进行试验，检测器为二极管阵列检测器，检测波长432 nm(金胺O)、484 nm(金橙Ⅱ)、508 nm(胭脂红、scarlet、酸性红73)。体积流量:0.6 mL/min。柱温:35℃。

图1 染色物质的薄层确定Fig.1 TLC chromatograms of Bovis Calculus artifactus and dyes

表1 人工牛黄中染色物质的HPLC-DAD流动相梯度表Tab.1 Gradient elution chart of HPLC-DAD

2.2.2 对照品溶液的制备 取金胺O试剂适量，精密称定，加70%乙醇制成每1 mL含50 μg的溶液;取金橙Ⅱ试剂适量，精密称定，加70%乙醇制成每1 mL含60 μg的溶液;取胭脂红、scarlet、酸性红73试剂适量，精密称定，加70%乙醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 同2.1.2项。

2.2.4 测定法 分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图及200～700 nm波长范围的紫外-可见吸收光谱图。

2.2.5 结果 相应供试品色谱中，呈现与金胺O、金橙Ⅱ、胭脂红对照品保留时间相同的色谱峰，相应色谱峰200～700 nm波长范围的紫外-可见吸收光谱图与金胺O、金橙Ⅱ、胭脂红对照品一致，结果见图2。供试品在26 min出现的色谱峰与scarlet、酸性红73对照品保留时间一致，但紫外-可见吸收光谱有明显差异。

2.3 伪品人工牛黄中染色物质的HPLC-MS验证

2.3.1 质谱条件 色谱条件同2.2.1项，质谱检测参数见表2。

2.3.2 结果 取2.1项下的对照品溶液和供试品溶液按照表2中质谱条件进行测定。

图2 金胺O、胭脂红、金橙Ⅱ、人工牛黄样品色谱图以及光谱图Fig.2 HPLC chromatograms and UV spectras of auramine O，orange II，Ponceau 4R，Calculus bovis artifactus

表2 人工牛黄中染色物质的质谱检测参数Tab.2 MS detection parameters

金胺O对照品主要色谱峰ESI+显示m/z268［M+H］+，与金胺 O的准分子离子［C17H21N3+H］+质量相符，以准分子离子峰为母离子的二级质谱中出现有 m/z107.07、131.06、147.09、252.15 的碎片离子，金胺O染色样品色谱与金胺O对照品相应色谱峰具有相同的质谱特征。

金橙II对照品主要色谱峰 ESIˉ显示 m/z327［M-Na］－，与金橙 II的准分子离子［C16H11N2O4SNa］－质量相符，以准分子离子峰为母离子的二级质谱中出现有 m/z107.04、155.99、171.00 的碎片离子，金橙II染色样品色谱与金橙II对照品相应色谱峰具有相同的质谱特征。

胭脂红对照品主要色谱峰ESI+显示m/z539［M+H］+，与胭脂红的准分子离子［C20H14N2O10S3+H］+质量相符，以准分子离子峰为母离子的二级质谱中出现有 m/z457.01、473.01、496.99、520.98 的碎片离子，胭脂红染色样品色谱与胭脂红对照品相应色谱峰具有相同的质谱特征。

3 结果

建立了伪品人工牛黄染色物质的检测方法并进行检测，5批伪品人工牛黄检出金胺O;1批伪品人工牛黄检出金胺O、金橙Ⅱ、胭脂红;1批伪品人工牛黄检出金胺O和胭脂红;2批伪品人工牛黄检出金橙Ⅱ。

4 讨论

4.1 为确保结果的准确，对TLC检测出色素的伪品人工牛黄进一步采用 HPLC-DAD、MS进行验证［4］。通过以上鉴定可以确认伪品人工牛黄非法染色物质为金胺O、金橙Ⅱ和胭脂红。色谱图中保留时间为26 min的红色素还有待进一步鉴定。金胺O(auramine 0)又名金胺、碱性嫩黄、金丝雀黄等［5］在国外已列为禁用染料，金橙Ⅱ(orange II)又称酸性橙Ⅱ、酸性橙7、酸性金黄Ⅱ［6］是食品禁用色素，金橙Ⅱ具有肾脏毒性［3］和致癌性［7］。目前已有文献报道在蒲黄、黄芩中检测出金胺O，在红花和丹参中检测出金橙Ⅱ［8］。胭脂红(ponceau 4R)又名胭脂虫色素，据报道，胭脂红对泥鳅红细胞具有一定的致突变作用［9］。低、中剂量组胭脂红会导致小鼠肾脏系数与阴性对照组相比有升高的趋势［10］。胭脂红收载于食品添加剂使用卫生标准，标准对胭脂红使用限量做出了规定，在后续研究中还应该增加胭脂红的定量测定，确保用药安全。

4.2 人工牛黄中胆红素价格较高，本实验同时对胆红素的薄层鉴别进行了研究，结果伪品人工牛黄中均未检出胆红素斑点。此外，对9批样品进行了炽灼残渣测定，结果有6批样品炽灼残渣超过90%，对这6批样品进行ICP-MS分析，结果显示Fe、Al、Mg量极高，有待进一步研究。

4.3 人工牛黄为贵细药，在中成药中多以原粉入药，为保证中成药质量，应进一步加大对中药材、中药饮片的市场监管，规范中药市场秩序，保证人民群众的用药安全。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:5-8.

［2］黄海萍，谭桂山.人工牛黄中胆红素研究进展［J］.中国药事，2005，19(2):114.

［3］饶伟文，蒋 玲，赵纯玉，等.几种染色参假中药的化工染料鉴定［J］.药物分析杂志，2007，27(11):1742-1745.

［4］苏 晶，程显隆，张聿梅，等.伪品血竭中染色剂苏丹红IV的检测［J］.中国药事，2008，22(4):318-320.

［5］赵纯玉，饶伟文，莫连峰.蒲黄中金胺O的HPLC测定［J］.药物分析杂志，2007，27(12);1956-1958.

［6］肖义夫，顾万江.高效液相色谱法同时测定食品中的金橙Ⅱ和苏丹红Ⅰ ～Ⅳ［J］.现代预防医学，2007，34(8):1547-1549.

［7］顾万江，肖义夫.食品中金橙Ⅱ反相高效液相色谱法测定［J］.预防医学情报杂志，2006，22(6):753-755.

［8］蒋永海.丹参中非法添加金橙Ⅱ的检测［J］.西北药学杂志，2010，25(4):245-246.

［9］张晓红，张虎芳.胭脂红对泥鳅红细胞微核的形成和核异常的影响［J］.中国西部科技，2006，(1):26.

［10］秦生辉，曾少祥，张 丹，等.胭脂红对小鼠内脏器官的影响［J］.咸宁学院学报:医学版，2009，23(1):18-19.