HPLC法测定峨参中峨参内酯

王岳峰， 刘苡菡， 耿 耘， 马超英

(西南交通大学峨眉校区，四川峨眉山614202)

峨参为伞形科峨参属植物峨参Anthriscus sylvestris(L.)Hoffm.的根，与峨蕊、雪磨芋，历来被人们认为是峨眉山的三大特产而闻名远近。中医认为峨参有补中益气，祛瘀生新之功效［1］。性甘、味辛、微苦，入脾、胃、肺三经。分布于峨眉山地区的神殿附近的峨山沟、九老洞、金顶，野生于灌木林缘、草坡。峨参中主要含有峨参内酯，具有杀虫、抑制癌细胞增殖，抗病毒、抗癌和抗有丝分裂的作用［2］。峨参属植物生长迅速，资源丰富。峨参在我国用作滋补强壮药，沿用历史悠久。国外学者对峨参、刺果峨参、东北峨参等植物做了部分研究，研究部位主要包括根，叶，花和种子等，从峨参中分离出杀虫、抗癌、抗有丝分裂、抗病毒的有效物质。峨参的化学成分主要有峨参内酯、异峨参内酯、水芹酮以及紫花前胡苷、东莨宕苷等。文献《Volatile components from Anthriscus sylvestris(L.)Hoffm.》是关于峨参化学成分研究的最新(2002年)的一篇报道，从峨参中用水蒸气蒸馏法分离得到数十种挥发性成分。国内有关峨参的研究，多是从生态学［3-4］、栽培学［5-6］等方面进行的。关于峨参化学成分方面的研究，国内文献报道微乎其微。目前，对峨参中峨参内酯的定量测定报道尚无研究。本实验旨在利用高效液相色谱法测定10个不同批次的峨参中峨参内酯，计算出其质量分数范围，为峨参的质量标准的制定提供基础性研究资料。

1 仪器、药品试剂及药材

1.1 仪器 岛津LC-20AT高效液相色谱仪，大连中汇达 VP-ODS C18柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm)。

1.2 药品试剂 峨参内酯对照品(实验室自制);甲醇为色谱纯(科密欧);水为超纯水;其他试剂均为分析纯，使用前均经0.45 μm微孔滤膜过滤。

1.3 药材 药材均由西南交通大学生命科学与工程学院宋良科教授鉴定。来源见表1。

表1 药材来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件 大连中汇达 VP-ODS C18柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm)，检测波长 293 nm，流动相甲醇-水(52∶48)为流动相，柱温35℃，体积流量1.0 mL/min。进样量 10 μL。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取峨参内酯对照品0.0075 g，用甲醇溶解并定容于100 mL量瓶中，配制成质量浓度为0.075 mg/mL的溶液，备用。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取峨参粉末4.0 g，置锥形瓶中，称定质量。样品瓶中直接加入48 mL规定浓度的甲醇溶液，回流3次，每次60 min，每次回流后，补足质量，过滤，冲洗滤渣和锥形瓶，合并3次滤液与洗液，减压蒸干，残渣加甲醇溶解，并定容于10 mL量瓶中。微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得供试品溶液。

2.4 标准曲线 取峨参内酯对照品溶液，分别精密吸取 2.5、5、7.5、10、12.5、15 μL 进入液相色谱仪，测定峰面积。试验结果表明:峨参内酯的标准曲线为 Y=570852.60X － 24604.56，r=0.9998(n=6)，峨参内酯在0.1875 ～1.1250 μg范围内进样量与峰面积成良好线性关系。

2.5 精密度试验 取质量浓度为0.075 mg/mL的溶液，精密量取10 μL，连续进样5次，考察峰面积，计算相对标准偏差，RSD为0.2088%。试验结果表明，精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密称取同一峨参样品4 g，按2.3 项方法制备供试品溶液，分别在 0、2、4、8、12、24 h进样10 μL，计算各色谱峰峰面积的相对标准偏差，峰面积的RSD=1.12%(n=6)，表明样品在24 h内基本稳定。

2.7 重复性试验 取同一批样品5份，依法制备成供试品溶液，精密吸取10 μL测定相对峰面积，计算相对标准偏差，RSD为1.9337%(n=6)，重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取已知量(0.0416%)的9 号样品 4.0 g，置锥形瓶中，称定质量。样品瓶中直接加入50 mL规定浓度的甲醇溶液，回流3次，每次60 min，每次回流后，补足质量，过滤，冲洗滤渣和锥形瓶，合并3次滤液与洗液，并用甲醇定容于25 mL量瓶中。精密吸取1 mL提取液，置100 mL量瓶中，再分别加入峨参内酯对照品0.0800 mg/mL的对照品溶液10 mL，用甲醇定容至刻度。平均操作5次，精密吸取10 μL在293 nm处测定吸光度，计算得回收率，结果表明平均回收率为100.3%，RSD=0.52%，回收试验良好。具体见表2。

表2 加样回收率试验结果

2.9 测定结果 取10个批次的样品，依次精密称定峨参粉末4.0 g，分别加入95%乙醇50 mL，称定质量，各提取1 h，放冷，再称定质量，用95%乙醇补足减失的质量，滤过并减压蒸干，残渣用甲醇定容于10 mL量瓶中。平行操作两次。测定峰面积，计算峨参内酯的量。结果见表3。

表3 测定结果

3 讨论

本研究是建立在考察了峨参内酯的提取工艺的基础上，通过HPLC测定方法的探索和方法学考察，根据对10批峨参中峨参内酯测定的结果，提出了在190～700 nm的波长范围对峨参内酯对照品进行紫外扫描，确定293 nm作为检测波长，峨参药材中峨参内酯的质量分数不应低于0.040%的建议。当然，是否有更能反映峨参质量的活性成分作为指标，还有待于进一步深入研究。

［1］王凤岐，吴大真.峨眉神效验方［M］.北京:科学普及出版社，1982:42.

［2］王志光，尹述凡.脱氧鬼臼毒素杀虫作用机理初步研究［J］.中国医药工业杂志，1992，23(2):65 ～68.

［3］夏光敏，李忠谊，于家驹，等.峨参原生质体的体细胞胚同步化发生及植株再生［J］.实验生物学报，1991，24(4):4-6.

［4］关若华，葛 滢，常 杰，等.明党参、峨参光合与生长的研究［J］.浙江大学学报，2003，30(5):584-586.

［5］殷现伟，常 杰，邱英雄，等.濒危植物明党参和非濒危植物峨参种子休眠和萌发比［J］.生物多样性，2002，10(4):425-430.

［6］盛海燕.环境因素对伞形科两种植物种子萌发的影响［J］.生态学报，2004，24(2):221-226.