树脂吸附法分离纯化锁阳中熊果酸的工艺研究

李贵文， 张明芮

(皖南医学院药学系，安徽芜湖241002)

锁阳又名不老药、锈铁棒、地毛球、羊锁不拉［1］，是锁阳科植物锁阳Cynomorium songaricum Rupr.的干燥肉质茎，具有补肾阳、益精血、润肠通便的作用，临床上主要用于腰膝痿软、阳萎滑精、肠燥便秘等证。锁阳还在防癌、抗癌、免疫系统调节、延缓衰老、防治心血管疾病、治疗白细胞减少等方面有明显的效果［2-4］。锁阳含多种化学成分及药用成分，其中，熊果酸是一种三萜类化合物，具有镇静、抗炎、抗菌、抗溃疡等多种生物学效应，熊果酸还具有明显的抗氧化功能，因而被广泛地用作医药和化妆品原料［5］。

传统醇提法得到的提取液中熊果酸量较低，不能很好的发挥熊果酸的药用价值。大孔吸附树脂具有吸附性强，解吸附容易，机械强度好，可反复使用和流体阻力小等优点。近年来大孔吸附树脂在天然药物化学成分的提取、分离纯化、制剂工艺改革、制剂质量分析等方面有了较广泛的应用研究［6］。本实验采用多种型号的大孔吸附树脂研究熊果酸的吸附和解析性能，筛选出最佳的树脂，并对影响吸附和解析的一系列工艺参数进行了研究。

1 仪器与试药

JASCO日本分光公司LC-2000高效液相色谱仪;PU-2086高压色谱泵;UV-2075紫外检测器;色谱工作站(HPLC-2000);色谱柱 HiQsil C18W(4.6 mm ×250 mm);玻璃层析柱￠10 mm×300 mm(美国Amersham Biosciences公司);X-5、D101、D1400、AB-8、DM130、DM301、DA201、NKA-9 大孔吸附树脂(天津市海光化工有限公司);ME235S电子分析天平(德国Sartorius赛多利斯);TDL-5离心机(上海安亭科学仪器厂);PHS-4CT型精密酸度计(上海大普仪器有限公司)等。甘肃产优质锁阳;熊果酸对照品(批号:110742-200516，中国食品药品检定研究院);色谱甲醇;其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 锁阳中熊果酸测定方法

2.1.1 色谱条件的确定 以保留时间定性，峰面积定量。根据文献［7］确定最佳色谱条件如下:流动相为甲醇－0.02 mol/L磷酸二氢钠(75∶25)，体积流量1 mL/min，检测波长220 nm;经精密度(RSD为0.37%)和加样回收率(98.6%)实验，表明仪器精密度良好。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取一定量的熊果酸对照品，置于250 mL量瓶中，加入流动相溶解并稀释至刻度，摇匀即得(8.74 μg/mL)。熊果酸对照品色谱保留值11.671。

2.1.3 样品测定 分别精密吸取熊果酸对照品溶液(经微孔滤膜过滤)5、7.5、10、12.5、15 μL 注入高效液相色谱仪，测定熊果酸峰面积积分值。以峰面积积分值为纵坐标(Y)，熊果酸进样量(X)为横坐标进行线性回归，求得回归方程Y=4170000X －11573(r=0.9998，n=5)，表明熊果酸质量在0.0437～0.1311 μg之间有良好线性关系。取供试品溶液，经稀释，微孔滤膜过滤后，进样10 μL，测定熊果酸峰面积积分值(Y)，代入回归方程计算熊果酸浓度。

2.2 样品中熊果酸测定［7］精密称取样品粉末(60目)约1 g，加入20 mL无水乙醇冷浸1 h后，用无水乙醇超声提取3次［20 mL(20 min)，15 mL(20 min)，10 mL(10 min)］，第 1次超声时用冷浸液，不再加无水乙醇。合并提取液滤过，置50 mL量瓶中，用无水乙醇定容。精密吸取2 mL置10 mL量瓶中，将无水乙醇挥干后，用流动相定容。经微孔滤膜过滤后，依上述色谱条件分析。平行进行三组实验，平均质量分数为0.726%。对照品及样品色谱图见图1。

图1 熊果酸对照品及样品HPLC色谱图

2.3 上柱溶液的制备［8］称取一定量的锁阳粉，用最佳提取条件提取熊果酸。提取液离心，取上清液浓缩回收乙醇后进行醇沉，除去多糖、蛋白质等杂质。再减压回收乙醇至无醇味，继续依次加入石油醚、二氯甲烷萃取，以除去锁阳中的色素和其他脂溶性杂质。将粗提物溶于蒸馏水，制成静态、动态吸附所需要的多种浓度。

2.4 静态吸附解析实验［9］

2.4.1 吸附量的测定 精确称取树脂1 g，处理后加入具塞锥形瓶中。精密加入熊果酸质量浓度2.27 mg/mL的上柱液100 mL，室温下震荡吸附24 h，取样分析，按下式计算吸附量(Q)。

Q(mg/g树脂)=(C0－Ce)×V/W

式中:C0—起始质量浓度，Ce—平衡质量浓度

V—吸附液体积，W—树脂质量

2.4.2 洗脱率的测定 将吸附了熊果酸的树脂滤过，用水洗涤，置于具塞锥形瓶中，加入90%的乙醇100 mL，室温下震荡解析24 h，取样分析，按下式计算解析率(D)。

D(%)=CDVD/［(C0－Ce)×V］×100

式中:CD—解析液质量浓度;VD—解析液体积

2.4.3 树脂的筛选 按照使用方法将树脂处理好，备用［10］。8种树脂在相同条件下对锁阳提取液中熊果酸的吸附量和解析率见表1。由表1可知DM130树脂的吸附量与解析率都较高，这与树脂的性质和熊果酸的性质密切相关，DM130树脂具有弱极性且比表面积也比较大，因而适于吸附非极性和弱极性的化合物，而熊果酸本身属于弱极性分子因而吸附量较高。虽然NKA-9的吸附量更高，但是由于极性较大，分子间作用力较强因而不宜解析。故选择DM130树脂进行进一步的实验。

表1 树脂的主要特征

2.5 DM130树脂对熊果酸的吸附性能［9］

2.5.1 静态吸附动力学过程 将一定量树脂放入上柱液中，使其充分吸附达到饱和，测定含量(平行测定2次，取平均值)。以吸附时间为横坐标，吸附量为纵坐标作出熊果酸在DM130树脂上的吸附动力学曲线。由图2可见，初始阶段吸附速率较快，100 min后吸附量增加缓慢，160 min后已基本达最大吸附量。

图2 吸附量随时间的变化

2.5.2 上柱液质量浓度对吸附性能的影响 取相同量的树脂，分别放入不同质量浓度的上柱液中使吸附达饱和，平行测定2次，取平均值。由图3可见浓度过低，过高都不利于吸附的进行，质量浓度过低树脂处理量大但需时较长，效率低;过高不利于吸附的进行，在初始质量浓度1.4～1.8 mg/mL之间吸附量达饱和。

图3 吸附量随上柱液质量浓度的变化

2.5.3 上柱液pH值对吸附性能的影响 称取相同量的树脂，分别放入不同pH值的上柱液中使吸附达到饱和，平行测定2次，取平均值。由图4可知在pH 5.7左右吸附量最大，pH过低熊果酸以佯盐形式存在，不利于其吸附，过高则以离子形式存在，极性增强，也不利于被弱极性的树脂吸附，

故选择pH 5.70作为最佳pH。

图4 吸附量随上柱液pH值的变化

2.5.4 上柱液体积流量对吸附的影响 在最佳上柱液浓度和pH条件下分别以1 BV/h(BV:树脂床体积)，2 BV/h，3 BV/h的体积流量进行动态吸附，定时取样(平行测定2次，取平均值)测定流出液质量浓度，以质量浓度200 mg/L作为溢出点。实验表明体积流量越慢越有利于吸附的进行，树脂的处理量越大，但体积流量过慢需时较长，效率低。在上柱液质量浓度1.64 mg/mL下，1 BV/h的上柱体积流量可处理的上柱液是18 BV，2 BV/h可处理16 BV，而3 BV/h只能处理11 BV，1 BV/h、2 BV/h处理的量相差不是太大，考虑到经济性选择2 BV/h作为最佳上柱体积流量。见图5。

图5 流出液中熊果酸质量浓度随床体积的变化

2.6 DM130树脂对熊果酸的解析性能

2.6.1 洗脱液质量浓度对解析性能的影响 配制不同质量浓度的乙醇洗脱液，先水洗已吸附达饱和的树脂至还原糖反应为阴性，再用15%的乙醇将杂质洗下，然后以相同洗脱体积流量对树脂进行动态洗脱，测定洗脱液质量浓度(平行测定2次，取平均值)，求得累积洗脱率。实验表明在含醇量为80% 时洗脱率已接近最大值，质量浓度过低不利于洗脱的进行，过高则会将色素等杂质一并洗下，影响产品质量，故选择最佳含醇量为80%。见图6。

图6 解析率随含醇量的变化

2.6.2 洗脱体积流量对解析性能的影响 分别采用0.5 BV/h，1 BV/h，2 BV/h的洗脱体积流量对已吸附达饱和的树脂进行洗脱，定量取样测定流出液中熊果酸的质量浓度(平行测定2次，取平均值)。结果表明，体积流量越慢洗脱效果越好，这主要是因为体积流量越慢越有利于熊果酸在树脂和洗脱液间进行相扩散和膜扩散，从而达到溶解平衡。由图7可见在0.5 BV/h的体积流量下，洗脱峰比较集中，3.5 BV的洗脱液就可达到洗脱完全，而其他体积流量则分别为5 BV和8 BV，因而选择0.5 BV/h作为最佳洗脱体积流量。

图7 洗脱液中熊果酸浓度随床体积的变化

2.7 产品的制备 在最佳的吸附和解析条件下对熊果酸进行吸附和解析，解析液浓缩，真空低温干燥后取样测定熊果酸量。平行进行3次实验，结果产品中熊果酸的量平均为46.1%。

3 结论

3.1 吸附树脂在分离中草药有效成分时的应用是利用吸附的可逆性(即解吸)。由于树脂极性、孔径、比表面积不同，对熊果酸吸附作用力强弱不同，解吸难易也有别。由实验从八种大孔吸附树脂中选择出了吸附和解析效果较好的弱极性树脂DM130。

3.2 得到了熊果酸吸附和解析的最佳工艺条件，即:质量浓度在1.4 ～1.8 mg/mL 范围内，pH 5.70，吸附流速 2 BV/h下，可处理样品溶液16 BV。在洗脱剂含醇量80%，洗脱体积流量0.5 BV/h下，3.5 BV就可将熊果酸充分洗脱下，过柱得率达到91.3%。产品浓缩，低温真空干燥，经液相色谱检测纯度达到46.1%，而原料中仅为0.726%，由此可见采用大孔树脂吸附法显著富集、纯化产品，效果良好。

［1］江苏新医学院编.中药大辞典(下册)［M］.上海:上海人民出版社，1997:2395.

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