不同方法提取海螵蛸多糖及结构表征

唐丽娟， 刘玮炜， 王 丽， 陈洁林

(淮海工学院化学工程学院，江苏连云港222005)

海螵蛸是一味传统海洋中药，为乌贼科Sepiidae海洋动物无针乌贼Sepiella maindionide Rochebrune或金乌贼Sepia esculenta Hoyle的干燥内壳。海螵蛸的药用价值早见于《本经》、《本草纲目》等古代药学巨著，记载海螵蛸具收敛、止酸、止血、涩精止带、敛疮等功效［1］。近年来，许多中外学者运用现代方法对海螵蛸的药理作用和临床应用进行了研究。证实海螵蛸具有抗胃溃疡［1-2］、成骨［3-4］、凝血［5］等作用。然而其作用机理尚不十分明确，就海螵蛸粉治疗胃溃疡等消化性溃疡疾病来说，目前临床研究认为与海螵蛸中主要成分碳酸钙［6］有关，能保护胃黏膜或抑制胃蛋白酶活性等［7-8］。然而海螵蛸中含有黏液、多糖及酶等物质［9］，魏江洲等［10］水提法获得海螵蛸多糖并进行体内实验，阐明了海螵蛸作为溃疡用药的药物作用机制。在文献基础上，本实验利用连云港产海螵蛸为研究材料分别采用水提法和碱提法提取多糖，并通过红外谱图对多糖结构进行了表征分析。此研究工作为海螵蛸资源的深入研究及中成药开发提供了一定的理论基础。

1 实验部分

1.1 原料、试剂和仪器

1.1.1 原料 新鲜海螵蛸(江苏连云港产，购于连云港新浦区苍梧生活广场)，经江苏省海洋生物技术重点实验室阎斌伦主任鉴定为金乌贼(Sepia esculenta Hoyle)内壳。

1.1.2 试剂和仪器 乙醇、盐酸、氢氧化钠、苯酚等均为国产分析纯。旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，722S可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)，WGH-30/6型双光束红外分光光度计(天津市港东科技发展有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 水提法提取海螵蛸粗多糖 将新鲜海螵蛸洗净晾干后研成粉末(过200目筛)，先用95%乙醇搅拌浸泡24 h，残渣用1.5 mol/L的盐酸常温浸泡24 h(其间强力搅拌)，抽滤，热水搅拌浸提滤渣，抽滤，残渣重复提取两次，合并3次水提液。浓缩水提液至原来体积的一半，6000 r/min离心10 min。上清液用sevage法(三氯甲烷-正丁醇=4∶1)反复除蛋白3次。浓缩上述提取液，加入2倍体积无水乙醇，搅拌均匀，室温静置过夜，次日，离心弃上清液，将沉淀复溶于蒸馏水，再离心，弃去不溶物，第2次醇沉，所得沉淀用蒸馏水溶解后透析48 h，透析液冷冻干燥，得海螵蛸多糖粗品，参照文献［11］苯酚-硫酸法测多糖量。

1.2.2 碱提法提取海螵蛸粗多糖 将水提后的残渣，以0.5%氢氧化钠碱溶液80℃搅拌浸提4 h。将碱提多糖溶液，用2 mol/L的盐酸溶液中和至pH=7.0，出现浑浊，进行旋转蒸发，将浓缩液抽滤，分别收集沉淀与清液，沉淀即为碱提水不溶多糖，干燥后称质量。然后将清液以流动水透析24 h，透析结束后向溶液中加入2～3倍无水乙醇，4℃下静置过夜，离心收集沉淀，该沉淀即为碱提水溶多糖［12］，干燥后称质量，计算两种多糖总提取率［碱提多糖总提取率=(碱提水不溶多糖质量+碱提水溶多糖质量)/提取原料质量×100%］。

2 结果与讨论

2.1 水提法提取海螵蛸多糖

2.1.1 液固比对海螵蛸水提多糖量的影响 分别准确称取50 g海螵蛸粉末，脱钙后残渣按液固比为4∶1、6∶1、8∶1加入蒸馏水，于70℃提取6 h，测多糖量。结果见图1。实验结果表明随着液固比的增加，多糖的提取率并没有提高反而呈下降趋势。在液固比为4∶1时，多糖提取率最大。而液固比为6∶1或8∶1时提取率较低，分析其原因可能是由于随着传质推动力的加大，随多糖一起浸出的杂质也增多，但在醇沉时，这些杂质没有随多糖一块沉淀，而且有可能夹杂一些多糖保留在醇溶液中［13］。

图1 液固比对水提多糖量的影响

2.1.2 提取温度对海螵蛸水提多糖量的影响 50 g海螵蛸粉末脱钙后残渣以液固比为4∶1，分别于70℃、80℃、90℃提取6 h，测多糖量，见图2。从图2看出，温度对海螵蛸多糖提取率有显著的影响。在70℃到80℃时，随着温度的升高，多糖提取率呈逐渐增大趋势。之后，随着温度的升高，多糖量明显下降，因此确定80℃时为较佳的提取温度。

图2 提取温度对水提多糖量的影响

2.1.3 提取时间对海螵蛸水提多糖量的影响 液固比为4 ∶1，于80 ℃分别提取4 h、6 h、8 h，多糖量测定结果见图3。随着浸提时间的增加，多糖的得率并没有增加趋势，6 h多糖得率最高，时间延长，导致多糖在提取温度下发生结构变化而使多糖有所损失。故提取时间选取6 h。

图3 提取时间对水提多糖量的影响

2.1.4 水提法重复性实验 取海螵蛸粉末3份各100 g，以上述获得的水提较佳工艺条件即提取温度80℃，液固比4∶1，提取时间6 h按1.2.2项进行3次平行提取实验(n=3)，结果见表1，RSD为4.39%，表明该方法较可靠。

表1 水提多糖重复性实验结果

2.2 碱提法提取海螵蛸多糖

2.2.1 提取时间对海螵蛸碱提多糖得率的影响 将水提后的残渣晾干后称等量的3份，以0.5%氢氧化钠碱溶液80℃条件下浸提4 h、6h、8 h，测定不同提取时间对海螵蛸碱提多糖得率的影响。由图4可知，提取时间对提取结果有一定的影响。提取时间短如4 h时，多糖提取率明显减少。当提取时间达6 h时，多糖的提取率达到较高，继续增加时间反而有所下降，故将多糖的最佳提取时间定为6 h。

图4 浸提时间对碱提海螵蛸多糖得率的影响

2.2.2 氢氧化钠溶液质量浓度对海螵蛸碱提多糖得率的影响 将水提后的等量残渣，分别以0.5 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L不同质量浓度氢氧化钠碱溶液80℃条件下浸提6 h，测定不同氢氧化钠溶液质量浓度对海螵蛸碱提多糖提取率的影响，结果见图5。随着稀碱提取质量浓度的增加，多糖的提取率逐步增加，当碱提质量浓度大于1.0 mol/L时，增幅有减小的趋势，当碱质量浓度大于1.5 mol/L时，提取率增加趋势平缓，可能是因为碱溶液质量浓度过大而破坏多糖的结构，另外随着浓度的提高，溶液的黏度不断增大，给后续的过滤、离心等环节增加不少工艺上困难。因此综合提取率及操作方便碱质量浓度选择1.5 mol/L。

图5 碱溶液质量浓度对多糖提取率的影响

2.2.3 提取温度对海螵蛸碱提多糖提取率的影响 将水提后的等量残渣，以1.5 mol/L氢氧化钠碱溶液于60℃、80℃、90℃、100℃条件下浸提6 h，测定不同提取温度对海螵蛸碱提多糖提取率的影响，结果见图6。由图6可以看出，在80℃时多糖的提取率最高，这可能因为低温时溶液中多糖不能得到充分提取;温度过高时，多糖有少量降解为可溶性单糖或低聚糖，而使提取率有所下降。因此选80℃为较佳提取温度。

图6 浸提温度对海螵蛸多糖的影响

2.2.4 碱提法重复性实验 取3份水提后残渣各100 g，以上述获得的碱提较佳工艺条件即提取温度80℃，氢氧化钠溶液质量浓度1.5 mol/L，提取时间6 h进行3次平行提取实验(n=3)，结果见表2，RSD为3.87%，表明该方法重复性较好。

表2 重复性实验结果

2.3 海螵蛸粗多糖结构表征

水提海螵蛸粗多糖:3492.0 cm－1强而宽吸收峰为多糖O-H 的伸缩振动，形成分子内氢键［14］，2800.0 cm－1小肩峰为C-H的伸缩振动，1630.0 cm－1中强吸收峰为C=O伸缩振动，1378.0 cm－1为 C-H 的弯曲振动，1100.0 cm－1的峰即C-O伸缩振动，562.0 cm－1为O-H面外弯曲振动。

碱提水溶性多糖:3408.0 cm－1为多糖O-H的伸缩振动;1582.0 cm－1为 C=O 伸缩振动;1350.0 cm－1为 C-H 弯曲振动，1254，1106.0 cm－1是 C-O 伸缩振动。

碱提水不溶多糖:3292.0 cm－1为O-H伸缩振动，形成分子间氢键;2928.0 cm－1是 C-H 伸缩振动;1582.0 cm－1C=O伸缩振动;1358.0糖环亚甲基C-H弯曲振动;1070.0 cm－1是C-O伸缩振动，在772.0 cm－1处的吸收则为吡喃对称环的伸缩振动。

从以上各种多糖的红外谱图分析可以看出，经水提和碱提获得的3种提取物均有多糖特征，如均在3600～3200 cm－1区域形成宽而强的峰，归属为糖分子中羟基的伸缩振动;分别在 1630.0，1582.0，1582 cm－1表现出酰胺Ⅰ带和Ⅱ带的吸收峰，表明多糖提取物中均可能存在酰胺基;在1200，1100 cm－1附近的吸收峰为C-O伸缩振动的吸收峰，是糖环的醚键(C-O-C)和羟基的吸收峰，表明粗多糖均可能存在糖环内醚结构。

但各多糖结构不完全相同，首先氢键类型不同:水提多糖和碱提多糖是分子内氢键，而碱提水不溶性多糖是分子间氢键。另外糖环类型可能不同。在IR谱图 中只有碱提水不溶性多糖在772.0 cm－1出现了吸收峰，表明其糖环可能是吡喃环构型。因此从红外光谱数据可以初步判断海螵蛸水提多糖和碱提多糖均具有多糖特征，但各多糖结构间存在着一定的差异。

3 结论

在水提法基础上，以碱提法提取江苏连云港产金乌贼海螵蛸中多糖。确定了水提法提取海螵蛸多糖的较佳工艺条件为提取温度80℃，液固比4∶1，提取时间6 h得到多糖量约为1‰。海螵蛸碱提多糖的最佳工艺条件为:提取温度80℃，氢氧化钠溶液质量浓度1.5 mol/L，提取时间6 h，多糖提取率约为7.008‰。海螵蛸水提粗多糖和碱提粗多糖均具有多糖红外光谱特征峰，水溶性多糖和碱提水溶性多糖红外谱图数据相似，碱提水不溶性多糖与前二者有一定差异。海螵蛸是传统海洋中草药，目前限于海螵蛸粉末的制剂配方，成分疗效不明确。因此本实验采用不同的提取方法获得水提多糖和碱提多糖，为海螵蛸资源的深入研究及中成药的开发提供一定的理论基础。

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