高效液相色谱法测定白及中肉桂酸

麻秀萍， 杨清秋， 蒋朝晖， 陆崇玉

(1.贵阳中医学院，贵州 贵阳550002;2.安顺市西秀区人民医院，贵州安顺561000)

白及系兰科植物白及Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.的干燥块茎，多年生草本，分布于贵州、四川、湖南、江苏等地，具收敛止血，消肿生肌之功效［1］，并收载于中国药典。临床上广泛用于治疗咳血吐血，外伤出血疮疡肿毒，皮肤皲裂，结核咳血，溃疡病出血等，疗效显著。白及含黏液质、对羟基苯甲酸、原儿茶酸、肉桂酸(Cinnamic acid)、联苄类等化合物［2-3］。目前，药典只收载其显微鉴定及薄层鉴别，未见有定量测定的报道。李及等人曾对白及中的大黄素甲醚进行定量测定，因其量甚微，没有检测的实际意义［4］。肉桂酸具有抗细菌、真菌作用和升高白细胞作用，是本品的有效成分之一［5］。故本实验采用HLPC法测定白及中肉桂酸，并进行方法学考察，结果表明建立的方法前处理简便，专属性强，测定结果准确、稳定，为白及药材质量控制标准的完善提供科学依据。

1 仪器和材料

Agilent 1100高效液相色谱仪(四元泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、化学工作站);肉桂酸对照品(C9H8O2，编号0786-9802，中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用)，乙腈为色谱纯，水为纯净水，其他试剂为分析纯。

白及药材采于贵州省关岭县，采集时间为2007年11月，经贵阳中医学院董立莎教授鉴定为药典品种兰科植物白及 Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.的新鲜块茎。鲜品洗净，部分去皮，皮与去皮块茎分别低温烘干，皮为1号样品，去皮块茎为2号样品;鲜品洗净，切片，烘干，为3号样品;鲜品按药典的炮制方法，蒸至无白心，去皮，切片，烘干，为4号样品。将4份样品粉碎，过60目筛备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验 色谱柱为Shim-Pack VP-ODS(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流动相为乙腈-0.1% 磷酸溶液(29∶71);柱温40℃;检测波长为285 nm。理论塔板数按肉桂酸峰计不低于4000。在此色谱条件下，肉桂酸与其他色谱峰完全分离，峰形较好。见图1。

图1 肉桂酸(A)与白及药材供试液(3号样品)(B)色谱图

2.2 对照品溶液的制备 精密称取肉桂酸对照品适量，甲醇溶解，摇匀，制成每1 mL含肉桂酸10 μg的对照品溶液。

2.3 供试液制备 取白及粉末1.0 g，精密称定，精密加入70%甲醇溶液25 mL，称定质量，超声提取30 min(功率250 W，频率33 kHz)，放冷，再称定质量，并用70%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。

24 方法学考察

2.4.1 线性关系的考察 精密吸取一系列质量浓度肉桂酸对照品溶液分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。以峰面积为横坐标，进样量为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为 Y=1.43799 ×10－7X －0.000435843(r=0.9999)，肉桂酸进样量在0.0232～0.2088 μg范围内，线性关系良好。

2.4.2 精密度实验 精密吸取肉桂酸对照品溶液(11.6 μg/mL)10 uL，按上述色谱条件连续进样5次，测定峰面积，RSD值为1.02%。

2.4.3 重复性试验 取白及粉末(3号样品)，按2.3项方法分别制备6份供试液，测定峰面积，计算白及药材中肉桂酸的平均质量分数为 268.16 μg/g，RSD 为 1.15%。

2.4.4 稳定性实验 取同一供试液，按上述色谱条件分别于 0、2、4、6、8 h 测定肉桂酸峰面积，RSD 值为 1.56%，结果表明白及供试液至少在8 h内测定稳定。

2.4.5 加样回收试验 取0.5 g白及粉末(3号样品)6份，精密称定，分别精密加入肉桂酸对照品适量，按2.3项方法制备供试液，照上述色谱条件测定峰面积，结果见表1。

2.5 样品测定 分别取不同加工方法和购于不同产地的白及，按2.3项方法制备供试液，照上述色谱条件测定，每个样品测定3份，计算质量分数，结果见表2。

表1 加样回收试验结果(n=6)

表2 白及药材中肉桂酸测定结果(n=3)

3 结果与讨论

3.1 提取条件的筛选 由于肉桂酸易溶于乙醚、丙酮、甲醇、苯等溶剂中，本实验比较了乙醚、甲醇、50%甲醇、70%甲醇，分别超声提取30 min的提取效果，结果以70%甲醇为提取溶剂时，提取效率高，且肉桂酸峰与其他色谱峰完全分离，故本实验选择70%甲醇溶液作为提取溶剂。另对提取时间20、30、60 min进行了考察，结果提取20 min时，量较低，提取30、60 min时的量相当，故选择提取时间为30 min。还对溶剂的用量进行了比较，定容至10 mL时，质量分数偏低，定容至50 mL时，溶液浓度过低，故定容至25 mL。

3.2 检测波长的确定 于190～400 nm波长范围对肉桂酸进行了扫描，经考察在285 nm波长处检测，肉桂酸峰灵敏度较高，其他色谱峰干扰较小，色谱峰的分离较为理想，故本实验选用285 nm作为检测波长。专属性考察采用二极管阵列检测器进行峰纯度检查，在样品色谱图中肉桂酸峰为纯峰，且溶剂对肉桂酸色谱分析均无干扰，方法的专属性强。

3.3 色谱条件的选择 比较了不同流动相的分离效果，以甲醇-0.1%磷酸溶液(25∶75)为流动相时，肉桂酸峰与前一个峰的分离不佳;以乙腈-0.1%磷酸(25∶75)为流动相时，肉桂酸峰对称性欠佳;根据肉桂酸峰与其前后两个峰分离情况及峰形，选择乙腈-0.1%磷酸溶液(29∶71)为流动相。本实验比较了不同色谱柱Shim-Pack VP-ODS(4.6 mm×150 mm，5 μm);Eclipse XDB-C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm);ZOBAX SB C18(4.6 ×150 mm，5 μm)的分离情况，均达基线分离。

3.4 经比较白及皮中肉桂酸量比去皮部分量高，按药典的炮制方法(蒸至无白心，去皮，烘干)炮制后的白及肉桂酸量最低。提示白及应用在抗病毒、抗菌和升高白细胞等方面时，应用其生品，且不去皮的白及效果可能更好。另对购于不同药店的白及药材进行了肉桂酸测定，结果质量分数过低，这与炮制方法相关，有待进一步研究。

致谢:贵阳中医学院徐文芬老师给予大力帮助!

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2005年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:95.

［2］韩广轩，王立新，王麦莉，等.中药白及的化学成分研究［J］.药学实践杂志，2001，19(6):360-361.

［3］韩广轩，王立新，顾正兵，等.中药白及中一新的联苄化合物［J］.药学学报，2002，37(3):194-195.

［4］李 及，张立新，周世玉.中药白及的质量标准研究［J］.成都中医药大学学报，2005，28(2):57-58.

［5］常新全，丁丽霞主编，中药活性成分分析手册［M］.北京:学苑出版社，2002:674.