天山雪莲凝胶剂质量标准研究

黄贤慧， 邢建国， 王新春，， 袁 勇， 陈卫军

(1.石河子大学药学院，新疆石河子832002;2.新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆乌鲁木齐830004;3.石河子大学医学院第一附属医院，新疆石河子832008)

天山雪莲凝胶剂由天山雪莲单味药材制成的维药新制剂，具有补肾活血，强筋骨，营养神经，调节异常体液等功效［1］，是治疗风湿性关节炎，关节疼痛的有效药物［2-3］。绿原酸和芦丁是天山雪莲中主要药效成分［4-5］。为有效控制制剂质量，本试验建立了同时测定天山雪莲凝胶剂中绿原酸和芦丁的高效液相色谱法和鉴别天山雪莲凝胶剂中绿原酸和芦丁的薄层色谱法，结果所建立的方法准确、可靠、专属性强，能有效控制天山雪莲凝胶剂的质量，为天山雪莲凝胶剂质量标准的研究提供了实验依据。

1 仪器与试药

日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪(LC-20AT二元高压泵，SPD-M20A二极管阵列检测器，SIL-20A自动进样器);pH酸度计(上海雷磁仪器厂);NDJ-1旋转黏度计(上海精密科学仪器有限公司);AE-200电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);Millipore simplicity-185超纯水器(美国密理博公司)。绿原酸对照品(批号:110753-200413)，芦丁对照品(批号:100080-200707)均由中国药品生物制品检定所提供。甲醇、乙腈为色谱纯(SK Chemicals公司)，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。天山雪莲凝胶剂由石河子大学药学院制备。

2 方法与结果

2.1 性状 本品为棕黄色半固体，均匀且细腻，稠度适宜，涂展性好。

2.2 检查

2.2.1 pH值 称取凝胶剂约1.0 g，用10 g蒸馏水稀释，在室温下测定 pH，范围为5.5 ～6.5。

2.2.2 黏度 采用NDJ-1旋转黏度计(1号转子、12 r/min)室温测定，结果为(183±6)MPa·s。

2.2.3 其他 应符合凝胶剂项下的有关各项规定(《中国药典》2010版一部附录IQ)。

2.3 定性鉴别［6］取本品约0.25 g，置10 mL量瓶中，加甲醇10 mL，超声5 min，离心，取上清液作为供试品溶液。同法处理空白凝胶，作为阴性对照溶液。另取天山雪莲药材约1.0 g，加入70%乙醇50 mL，回流提取1 h，离心，取上清液作为对照药材溶液。再分别取绿原酸、芦丁对照品适量，加甲醇溶解制成每1 mL含0.5 mg绿原酸和0.5 mg芦丁的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验［2］，分别吸取上述5种溶液各10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶6∶1∶2)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.1%亚硝酸钠的1%甲醇溶液，加热至斑点显色清晰。结果，供试品色谱在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色斑点，而阴性对照品溶液无此斑点，见图1。

图1 天山雪莲TLC鉴别

2.4 定量测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱:Waters ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈(A)-0.4% 磷酸(B)，0 ～ 13 min 12%(A)，13 ～16 min 12%(A)-15%(A)，16 ～40 min 15%(A);检测波长:353 nm;体积流量:1 mL/min;柱温:35℃;进样量:10 μL。在此色谱条件下，供试品中绿原酸及芦丁的保留时间为 8.2 min和 31.2 min，理论塔板数依次为 4000、9000。色谱峰达到完全分离，绿原酸及芦丁与相邻峰的分离度均大于2且峰形对称，绿原酸及芦丁的对称因子分别为1.17 和 1.13。

2.4.2 标准曲线的制备 分别精密称取绿原酸、芦丁对照品适量，加甲醇溶解，定容，所得绿原酸、芦丁的质量浓度分别是 0.48 mg/mL、0.65 mg/mL，作为对照品贮备液;再分别精密吸取绿原酸、芦丁对照品贮备液各2.5 mL至25 mL棕色量瓶，甲醇定容，配成绿原酸、芦丁的质量浓度分别为48.0 μg/mL、65.0 μg/mL混合对照品贮备液。精密吸取混合对照品贮备液 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10 mL 至 10 mL 棕色量瓶，甲醇定容，摇匀，制成系列质量浓度的混合对照品，以峰面积A为纵坐标，绿原酸、芦丁质量浓度C(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线，并进行线性回归。绿原酸回归方程为:A=12010C，r=0.9998，其质量浓度在 2.4 ～48.0 μg/mL 范围内与峰面积呈良好的线性关系;芦丁回归方程为:A=18256C，r=0.9997，其质量浓度在 3.25 ～ 65.0 μg/mL 范围内与峰面积呈良好的线性关系，且标准曲线通过原点，因此可采用外标一点法进行定量测定。

2.4.3 供试品溶液的制备 取本品约0.05 g，精密称定，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇约15 mL，超声5 min，放置至室温，定容，取1.0 mL提取液至5 mL棕色量瓶中，甲醇定容，摇匀，离心10 min，取其上清液过0.22 μm滤膜，取续滤液，作为供试品溶液。

2.4.4 空白干扰试验 按处方中各成分比例，制备不含天山雪莲的空白凝胶，按“供试品溶液制备”方法制备空白溶液，依法测定，结果无干扰。见图2。

2.4.5 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，按上述色谱条件，重复进样6次，分别测定供试品溶液中绿原酸及芦丁峰面积值，结果供试品绿原酸峰面积值RSD为0.58%;芦丁峰面积值RSD为0.40%。

图2 天山雪莲凝胶HPLC图

2.4.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，按上述色谱条件，每隔2 h测定供试品溶液中绿原酸及芦丁峰面积值，共测定6次，结果供试品绿原酸峰面积值RSD为1.24%;芦丁峰面积值RSD为1.06%。

2.4.7 重复性试验 称取本品6份，各约0.05 g，精密称定，照2.4.3项供试品溶液的制备项处理，按2.4.1项测定项色谱条件进行测定，结果绿原酸峰面积值RSD为1.75%;芦丁峰面积值RSD为1.93%。

2.4.8 加样回收率试验 分别取供试品凝胶6份，每份约0.025 g(含绿原酸约 0.8355 mg，含芦丁约 1.669 mg)，精密称定，分别置50 mL量瓶中，各精密加入混合对照品溶液，按照2.4.3项供试品溶液的制备项处理，离心10 min，取其上清液，过0.22 μm后，按2.4.1项测定项色谱条件进行测定，记录色谱图，并计算绿原酸平均回收率为101.18%，RSD为0.57%(n=6);芦丁平均回收率为 102.12%，RSD 为 1.41%(n=6)。结果见表1。

表1 绿原酸及芦丁回收率测定(n=6)

2.4.9 样品测定 分别按照2.4.3项供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按2.4.1项色谱条件分别测定3批样品。结果见表2。

表2 3批样品测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 在建立检测天山雪莲凝胶剂样品中的绿原酸和芦丁的HPLC色谱条件时，参考相关文献［7-8］，采用双波长检测法进行考察，即在327 nm处检测绿原酸，257 nm处检测芦丁。结果，通过提取色谱图发现，双波长检测法所得绿原酸和芦丁的峰形及分离度均不理想。另参考中国药典2010年版和相关文献［9-10］，检测波长为340 nm。通过提取色谱图发现，绿原酸的分离度达不到要求，且芦丁的峰形对称性不理想。因此，本实验依据全波段扫描结果(绿原酸最大吸收波长为325 nm，芦丁最大吸收波长分别为254 nm及353 nm)，在检测波长为353 nm，所得绿原酸和芦丁色谱图的峰形与分离度均达到要求。

3.2 在建立高效液相色谱法同时测定天山雪莲凝胶剂中绿原酸和芦丁色谱条件时，流动相的选择参考文献［11-12］，采用了甲醇-磷酸、乙腈-磷酸系统进行考察，结果乙腈(A)-0.4%磷酸(B)，0～13 min 12%(A)，13～16 min 12%(A)～15%(A)，16～40 min 15%(A)时，绿原酸和芦丁的峰形均对称，分离完全，阴性样品无干扰。方法准确、灵敏、快速、重现性好，可作为该制剂的含量控制方法。

3.3 经3批样品中绿原酸和芦丁测定，绿原酸质量浓度在16.60～16.81 mg/mL，芦丁质量浓度在 33.03 ～33.73 mg/mL，因此考虑到实际生产中天山雪莲药材的来源，以及提取、纯化过程、储藏环境等因素对含量的影响，故暂定本品:每克含绿原酸不得少于13.37 mg;每克含芦丁不得少于26.70 mg。

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