莱菔子饮片中萝卜苷测定方法的研究

吕文海， 任 涛， 孟祥红， 苏永汶

莱菔子是具“生熟异治”、“生升熟降”药性特点的常用中药，炒后长于消食除胀、降气化痰［1］。经系统分析，发现莱菔子生、炒品中气味和挥发性部位存有明显的质变与量变成分，但两者含量很微［2］。在水溶性部位中发现并分离鉴定了两个含硫新化合物A209与B221，HPLC含测证明，二者主要存在于生莱菔子中，炒制后A209量显著降低，B221未检测到。A209 系 S-6-甲亚砜基甲基-1，3-噻嗪烷-2-硫酮，S-6-(methylsulfinyl)methyl-1，3-thiazinane-2-thione，CCDC号:742902;B221为 N-(E)-(4-甲亚砜基-3-丁烯基)胺基硫代甲酸乙酯，O-ethyl N-(E)-4(methylsulfinyl)but-3-enylcarba mothioate，CCDC 号:742907［3］。莱菔子生、炒品成分群 HPLC图谱分析表明A209与B221是化合物C3在不同条件下的转化产物，进一步证明C3为莱菔子素，莱菔子素是硫代葡萄糖苷类成分萝卜苷的酶解产物［4-5］。在尚未分离到萝卜苷对照品的情况下，以烯丙基硫苷为内标物，以HPLC图谱中莱菔子硫苷与内标物峰面积之比为指标，比较不同炮制品中的硫苷相对质量分数并用均匀设计优选炮制工艺，证明炒莱菔子有利于硫苷类成分的保存［6］。

基于上述工作，本实验建立了莱菔子水煎剂中萝卜苷的HPLC测定方法，并证明了该方法在反映莱菔子生、制品特征方面的专属性。

1 实验材料

1．1 供试饮片

莱菔子购于鄄城良海中药饮片有限公司，经山东中医药大学药学院生药系周凤琴教授鉴定为十字花科植物萝卜Raphanus sativus L．的干燥成熟种子，符合《中国药典》(2010年版)药用规定。按确定的净制工艺净选后作生莱菔子样品。

炒莱菔子 按参考文献［6］确定的工艺参数炒至质地鼓起，易脱皮，富油性并有爆裂声和特有香气溢出时，取出，晾凉。

莱菔子炒过品 在炒品的基础之上继续炒制，炒至颜色加深、表面焦糊时，取出，晾凉备用。

上述供试饮片，粉碎成粗粉，置干燥器内平衡水分后备用。

1．2 仪器与试剂 Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司);SB2200超声波清洗机(上海必能信超声有限公司)。

乙腈为色谱纯(山东禹王实业有限公司)，其他试剂为分析纯。

1．3 萝卜苷对照品 自制。为淡黄色半固体油状物，易溶于水，微溶于甲醇等极性较大的有机试剂。经MS、1H-NMR、13C-NMR 检测，相关数据与文献［7］对照，确定为萝卜苷。HPLC面积归一化法测定其纯度大于92%。

2 实验方法与结果

2．1 色谱条件 色谱柱为Phenomenex-C18(4．6mm×250 mm，5μm);以乙腈-0．1%的磷酸水溶液(5∶95)为流动相;设定体积流量1．0 mL/min，柱温30℃，进样量20μL;经萝卜苷全波长扫描(见图1)，以225 nm为检测波长，360 nm为参比波长。

图1 萝卜苷紫外吸收光谱图Fig．1 UV spectra of glucoraphenin

2．2 供试品溶液的制备 根据萝卜苷的溶解性，按照中医主用汤剂入药的实际，采用水回流提取制备莱菔子供试样品:取供试品粉末0．1 g，精密称定。置50 mL烧瓶中，精密加水25 mL，浸泡30 min，称定质量。回流提取1．0 h，补足损失质量，抽滤，滤液经0．45μm微孔滤膜过滤后备用。

2．3 对照品溶液的制备 精密称取萝卜苷对照品0．007 55 g，纯净水溶解，定容至10 mL。依次稀释配制成质量浓度为 0．755、0．604、0．453、0．302、0．151、0．075 5、0．037 8 mg/mL 的对照品溶液。

2．4 萝卜苷HPLC检测方法学考察

2．4．1 线性关系考察 用2．3项中的对照品溶液，按2．1项下色谱条件测定，以峰面积(Y)对萝卜苷质量浓度(X)进行线性回归，得回归方程为Y=12 428X+38．398(r=0．999 8)。实验表明萝卜苷质量浓度在0．755～0．037 8 mg/mL范围内，峰面积与质量浓度呈良好的线性关系。

2．4．2 精密度实验 取2．3项下质量浓度为0．302 mg/mL的萝卜苷对照品溶液，按2．1项下色谱条件连续进样5次，测定萝卜苷的峰面积为:3 729．8、3 746．8、3 760．4、3 772．3、3 789．8，平均值为3 758．8，RSD 为0．61%，表明仪器精密度良好。

2．4．3 稳定性实验 按2．2项下方法制备炒莱菔子供试品溶液，分别于 0、0．5、1、2、4、6、8 h 时按 2．1项下色谱条件进样，根据萝卜苷的峰面积计算其质量分数(%)，分别为:8．13%、8．08%、8．11%、8．13%、8．12%、8．20%、8．13%，平均值为 8．13%，RSD为0．44%，表明供试品溶液在制备后8 h内稳定性良好。

2．4．4 重现性实验 按2．2项下方法平行制备炒莱菔子供试品溶液5份，按2．1项下色谱条件进样，根据萝卜苷的峰面积计算其质量分数，分别为:8．08%、7．78%、8．02%、8．21%、8．05%，平均质量分数为8．03%，RSD=1．96%，表明方法的重现性良好。

2．4．5 加样回收率实验 精密称取5份已知量的炒莱菔子样品各0．1 g，用减重法加入与待测样品萝卜苷量近似的萝卜苷对照品，按样品测定方法处理，测定，计算加样回收率。结果见表1，实验表明本方法回收率符合测定要求。

表1 炒莱菔子供试品加样回收率实验结果Tab．1 Results of plus samp le Recovery in Raphani Semen

2．5 莱菔子不同炮制品中萝卜苷的测定 分别取莱菔子生、炒、炒过品各0．1 g，精密称定。按2．2项下要求制备供试品溶液，并按2．1项下色谱条件进样，进行测定。结果见表2，实验表明，莱菔子炒品中萝卜苷是生品的8．55倍，如炒过则萝卜苷损失殆尽。实验证明萝卜苷量可以客观反映莱菔子的炮制程度，具有质量控制上的专属性。HPLC图见图2。

表2 莱菔子不同炮制品中萝卜苷测定结果(n=3)Tab．2 Determ ination of glucoraphenin in different processed Raphani Semen(n=3)

图2 莱菔子不同炒制品图谱Fig．2 Spectra of different roasted Raphani Semen

3 小结与讨论

建立能反映中药炮制过程中相关成分变化，控制饮片炮制程度的专属性质控方法，是中药炮制机理研究的重要内容，是使饮片炮制规范化的关键技术。本实验首次从炒莱菔子中分离纯化了其所含硫苷类化合物的主成分萝卜苷，并建立了莱菔子水提液中萝卜苷的HPLC测定方法。

实验结果表明，在莱菔子炒制达到优选工艺中形、色、气、味、质要求的前提下，其水煎剂中萝卜苷量是生莱菔子的8．55倍，如炒过，萝卜苷则无法检出。结合炮制品性状要求，萝卜苷定量测定可作为有效反映莱菔子炮制程度的专属性质量控制方法。

实验中发现，莱菔子如仅微炒，在达不到传统要求的形体鼓起，种皮易捻脱，富含油性，具浓郁特殊香气等性状要求时，萝卜苷的量要高于优选工艺炮制品。但中药饮片是为中医临床服务的，炮制中特有的“火候”要求，是在长期临床验证中形成的，在饮片入药的形式下，饮片的特有性状要求必须得到充分的继承。否则，仅以萝卜苷量为标准，获得的将是临床不认可的炒莱菔子，性状与萝卜苷定量测定相结合的方法，可以更客观有效地保证莱菔子的炮制质量。这在中药炮制机理和质量控制方法研究中必须引起足够的重视。

［1］龚千锋．中药炮制学［M］．北京:中国中医药出版社，2005:109．

［2］张 欣，王爱武，宿廷敏，等．莱菔子生制品挥发性成分GC-MS分析［J］．中成药，2008，30(1):96-98．

［3］Zhang Xin，Liu Hongbing，Jia Jingjing，et al．Two novel sulfur compounds from the seeds of Raphanus sativus L．［J］．J Asian Nat Prod Res，2010，12(2):113-118．

［4］任 涛，吕文海，张 欣，等．莱菔子炮制前后成分群变化的初步研究［J］．中成药，2009，31(11):1715-1718．

［5］吕文海，任 涛，苏永汶，等．炮制抑制莱菔子中萝卜苷酶解转化的初步研究［J］．中国中药杂志，2011，36(8):980-983．

［6］任 涛，吕文海．以硫代葡萄糖苷相对含量优选莱菔子炮制工艺研究［J］．中成药，2010，32(7):1159-1162．

［7］Iori R，Barillari J，Gallienne E，et al．Thio-functionalised glucosinolates:unexpected transformation of desulfoglucoraphenin［J］．Tetrahedron Lett，2008，49:292-295．