急性脊髓损伤后线粒体的功能变化

程 刚综述,张 宁,蔡卫华审校

0 引 言

急性脊髓损伤(acute spinal cord injury,ASCI)是一种后果极其严重的创伤,虽然在过去的几十年里其死亡率从 50%已经下降了到目前的 6%[1]。目前研究结果都表明脊髓损伤的机制和损伤后线粒体形态和功能的变化有着密切的关系。在形态上线粒体主要变现为线粒体体积增大、膜结构不清、线粒体嵴肿胀水肿、嵴腔扩大、嵴排序紊乱。功能上,ASCI后的继发性损害是加重脊髓神经功能损害的主要因素。原发性脊髓损伤后导致的神经元和神经胶质细胞的丢失和死亡会导致持续的继发性神经元的损失或死亡[2]。此外,ASCI的有害因素主要有脊髓组织局部的缺血、缺氧、过氧化基团生成及细胞内成分的改变,其都会影响线粒体的形态和功能。ASCI后原发性损伤病变向纵、横向逐渐发展,神经元的丧失程度要根据损伤的时间和距损伤震中的距离而决定的。随着时间的延长,损伤会从震中不断向远处扩散,病变损伤范围不断扩大[3]。线粒体变化机制主要包括如下几个方面。

1 线粒体能量代谢的紊乱

线粒体能量代谢主要由呼吸功能来体现,体现线粒体呼吸功能的重要参数有以下几点[4]:线粒体呼吸Ⅲ态(R3)、呼吸Ⅳ态(R4)、呼吸控制率(respiratory control ratio,RCR=R3/R4)和磷氧比值(P/O比值)。P/O是指消耗 1摩尔氧原子所生成 ATP摩尔数,P/0比值反应的是线粒体利用氧化释放能量转化为 ATP的效率,它是线粒体氧化磷酸化效率和呼吸功能的重要指标。氧化磷酸化脱偶联可以导致P/O比值下降,同时损伤后由 R3降低和 R4升高共同变化造成线粒体 RCR的变化,RCR的变化也说明线粒体氧化磷酸化偶联程度明显受到抑制,利用氧化释放能量转化为 ATP的效率明显降低。有研究报道脑创伤后6～12h后,线粒体呼吸活性 R 3、RCR、P/0和氧化磷酸化效率(oxidative phosphorylation ratio,OPR)均明显下降,R4相对正常或升高[4]。线粒体能量代谢紊乱的原因主要有以下几个方面。

1.1 线粒体膜损伤 ASCI后线粒体膜通透性增加、肿胀、水肿,线粒体膜有序结构改变导致质子回流,从而使 H+泵发生障碍,膜转运功能降低加重水肿。创伤诱导 Ca2+进入神经元,这就激活了由磷脂酶介导的水解作用,从而释放大量的游离脂肪酸类(free fatty acid)造成对线粒体膜的损伤[5],同时又影响线粒体的能量代谢功能。

1.2 呼吸抑制剂或解偶联剂的生成 ASCI产生一些线粒体呼吸抑制剂或解偶联剂,可直接抑制多种线粒体的电荷传递而影响能量代谢,如活性氮和过氧亚硝酸盐等自由基,内源性过氧亚硝酸盐对线粒体的细胞色素 C氧化酶形成不可逆的损伤,同时也会对线粒体其他结构构成损伤[6]。自由基也是一种很强的炎症介质,细胞膜极易遭受自由基的攻击。它主要破坏细胞或亚细胞器膜脂质分子,自由基产生增多使膜肽分子链断裂、损坏、变性,导致线粒体脂质层变薄、分子流动性降低、出现细孔影响脊髓线粒体内膜底物通透,而影响线粒体的氧化磷酸化。解偶联剂则可以破坏线粒体膜两侧的电化学梯度使能量生成受到抑制。

1.3 组织缺血、缺氧 脊髓组织缺血、缺氧使线粒体呼吸功能受抑制。其机制为缺氧使 NADH不能经呼吸链氧化成 NAD+,导致使 NAD+生成减少、NADH堆积增多,NAD+/NADH比值下降,抑制柠檬酸合成酶的活性,柠檬酸合成酶是三羧酸循环的主要调节点之一,它的活性抑制会使三羧酸功能下降,ATP生成减少。

1.4 其他方面 此外,ASCI后发生继发性缺血、缺氧会导致自由基不断的生成会减少多不饱和脂肪酸链的长度,破坏脂质双分子层的完整性,使线粒体膜流动性降低、通透性增加[7]。而膜流动性降低会对Na+-K+-ATP酶、细胞色素氧化酶、膜受体功能产生损害,细胞色素氧化酶是线粒体呼吸链的酶复合体的重要组成,Na+-K+-ATP酶、细胞色素氧化酶以及膜受体是线粒体发挥正常生理功能所必须的,进而抑制了线粒体呼吸功能。

2 线粒体活性氧的生成

活性氧(reactive oxygen species)是体内一类氧的单电子还原产物,是含有氧元素但比普通状态的氧更具活性的一类分子,它对组织和细胞的损伤主要表现为脂质过氧化作用(lipid peroxidation,LPO),活性氧可使磷脂分子不饱和脂肪氧化生成过氧化脂质,损伤线粒体膜。活性氧主要包括氧自由基、羟自由基、过氧化氢、过氧化物、过氧亚硝酸盐。活性氧可直接与蛋白、脂质、核酸等发挥作用使其失去功能,也可以起到中间信使作用[8]。机体对活性氧的反应也可以造成继发性损伤,继发性脊髓损伤的原因部分是来自于对原发性损伤产生的物质的反应,这些物质就包括活性氧、活性氮,这些都是引起损伤后继发性细胞死亡的重要因素。目前活性氧对脊髓的损伤已得到广泛的证实,在 ASCI 1h后,检测线粒体中活性氧水平试验显示活性氧上升缓慢,活性氧水平虽有上升但无明显差异,脊髓损伤后4h后,活性氧水平却升高48%[9]。在脊髓损伤后 24 h后,过氧化氢酶的活性和谷胱甘肽(glutathione)水平却升高更加明显,这些都说明线粒体的功能、活性氧水平、脂质过氧化作用在损伤后变化很快[10]。

2.1 活性氧产生机制

2.1.1 炎症反应 在脊髓损伤后的炎症反应也与活性氧的生成关系密切。在脊髓损伤后,组织的缺血、缺氧、水肿会使血管内皮细胞受损而生成炎症介质,这些介质包括肿白细胞介素-1、5羟基花生四烯酸等致炎细胞因子和炎性趋化因子,它们使黏附分子表达增加,中性粒细胞和单核细胞释放的化学介质也会增加,这些因素共同导致中性粒细胞和单核细胞浸润和活化。活化的中性粒细胞和单核细胞在局部吞噬坏死组织并且释放蛋白水解酶,产生大量的活性氧和溶酶体酶,活性氧和溶酶体酶又可成为炎性介质,促进炎症反应和炎症破坏。

2.1.2 补体系统 炎症激活的补体系统也会产生大量活性氧,其中补体活化片段 C5a是中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞的趋化因子,它可增加白细胞表面的整合素的亲和力,促进白细胞黏附,增强炎症反应而激发活性氧大量产生,大量的活性氧加重氧化损伤。活性氧激活补体又可诱发中性粒细胞进一步产生活性氧,这样就形成了补体活化与活性氧增加的正反馈机制[11]。

2.1.3 其他途径 脊髓损伤缺血缺氧引起能量代谢障碍,ATP降解、氧化还原不完全可产生活性氧。除上述产生途径外,细胞外 Ca2+内流,激活磷脂酶,脂质降解增强,也会生成活性氧,线粒体内外 Ca2+失衡也会诱导线粒体膜电位的降低使活性氧生成增加。Fe3+也可以作为催化剂催化介导体内羟自由基生成[12]。

2.2 活性氧的损伤机制

2.2.1 脂质过氧化作用 活性氧的氧化应激作用在脊髓损伤中得到广泛实验的证实,脂质过氧化反应可能是活性氧对线粒体损伤的主要过程。脊髓损伤后过量的活性氧能通过与不饱和脂肪酸脂质过氧化反应攻击线粒体膜,破坏膜的完整性,活性氧及其导致的 LPO与神经细胞创伤的关系是紧密联系的,其中丙烯醛(acrolein)和羟基壬烯醛(hydroxynonenal,HNE)是脂质氧化作用过程中最具有毒性的副产品,这些醛类产物的积累会对线粒体损伤起着重要作用[13],如 HNE可促进神经肽等的释放而引起相关的炎症反应。损伤组织中肿瘤坏死因子、一氧化氮等介质的含量增高也不仅会对线粒体膜造成损伤,还可以生成氧自由基和氮过氧化物加重损伤。

2.2.2 活性氧与线粒体 Ca2+超载 原始的机械损伤会造成脊髓组织的水肿和局部缺血,细胞和亚细胞器的膜结构的通透性增加,Ca2+会大量进入胞质导致钙超载。继发性的损伤同样会形成钙超载,其可作为信号诱导线粒体通透性转变孔(mitochondrion permeability transition pore,MPTP)开放 ,MPTP的蛋白构成包括线粒体内膜上的腺苷转为分子、线粒体外膜的电压依赖性离子通道和线粒体基质的亲环素 D[14]。它的开放可引发 Ca2+内流与线粒体电子传递链解偶联,同时促进自身线粒体及其他线粒体产生活性氧 ,使活性氧损伤作用正向反馈扩大。损伤后细胞内的 Ca2+内流超载是细胞死亡的最后共同途径,一旦细胞内 Ca2+清除功能障碍或者细胞内储钙库释放就会增加细胞内 Ca2+聚集,引起钙依赖性蛋白酶和磷脂酶的活化,导致细胞骨架蛋白水解、花生四烯酸堆积和脂质氧化作用的发生[15],最终导致细胞死亡。

2.2.3 活性氧与细胞凋亡 细胞凋亡是某些体内外因素触发的细胞主动死亡方式。活性氧是一类很活泼的化学分子。活性氧可以直接与生物大分子作用,引起细胞的氧化应激而损伤细胞及细胞器,也可以作为触发因素通过调控凋亡相关基因表达诱发神经元凋亡,还可以改变细胞内酶活性,使 cAMP和cGMP浓度升高影响细胞增殖分化。Fas、Bax、P53都有能促进细胞的凋亡作用。Bax是 Bcl-2家族中促凋亡的成员之一,Bcl-2与 Bax的比值在线粒体介导的细胞凋亡通路起着关键的作用,比值减少会增加线粒体膜的通透性而加重线粒体损伤[16]。刺激信号活性氧升高的作用下可以上调 Bax的表达,Bax通过作用于 MPTP,降低线粒体跨膜电势,促使线粒体释放细胞色素 C和凋亡酶(Caspases)的激活,以及其他凋亡诱导因子的释放促进细胞凋亡[17]。活性氧对线粒体或细胞的损伤可以引起机体内某些物质变化以起到防御性或保护的作用,例如,胞外的抗坏血酸的生成增多就是针对活性氧而产生保护作用[18],这可以减少活性氧对细胞的损伤。当活性氧的氧化效应超过了体内抗氧化防御机制的清除作用时,就会启动脂质过氧化反应,导致生物膜包括线粒体内外膜的完整性和通透性发生改变,生成醛类产物抑制 ATP酶活性,进一步损伤线粒体功能,线粒体功能的进一步受损,导致更多的活性氧生成。由此构成了氧化应激的恶性循环,导致细胞功能障碍并最终死亡[19]。

3 线粒体内钙超载

Ca2+是最普通的信号传导元素,但与其他第二信使分子不同,Ca2+过量会导致细胞损伤和死亡。因为钙不能像其他第二信使分子一样被分解代谢,只能通过细胞进行调节。大量的细胞内蛋白和一些细胞器通过与 Ca2+结合和分离来确保内环境的稳态。线粒体就是其中最为主要的一种细胞器,细胞内 Ca2+的超载已被认为是神经细胞死亡的最后共同途径。ASCI后,在线粒体中游离 Ca2+的变化虽然早已引起人们重视,但研究结果尚不多。原因是测定线粒体游离 Ca2+比较困难,荧光探针 Reers法[20]使这一难题已得到初步的解决,人们发现脊髓损伤以后细胞外Ca2+内流超载,Na+-Ca2+交换体(Na+-Ca2+exchanger)在脊髓损伤后可导致细胞及线粒体内Ca2+浓度升高方面起着重要作用[21]。而且损伤部位周围的 Ca2+也流入损伤组织,细胞内外的 Ca2+都增加。钙超载的损伤机制主要有以下几方面。

3.1 直接组织损伤作用 ASCI后,线粒体内 Ca2+增加可激活蛋白溶酶和脂质溶酶,引起细胞器和膜结构损伤或细胞自溶,如钙依赖性磷酸脂酶和磷脂酶等导致细胞膜被破坏,而且其产物如花生四烯酸、血栓素、白三烯和自由基可以通过炎症反应而加重组织的损伤。此外,Ca2+作为凝血因子在凝血过程中起着重要的作用,ASCI后细胞内外的 Ca2+浓度都增加,它可以迅速激活凝血酶形成局部血栓形成,导致微循环障碍、脊髓水肿[22]。

3.2 干扰能量代谢 Ca2+清除功能障碍或者是线粒体内释放 Ca2+,均可以增加细胞内 Ca2+积聚,Ca2+作为第二信使使钙依赖性蛋白酶和磷脂酶的活化,影响线粒体的呼吸功能和能量代谢,最终导致细胞的死亡,线粒体 ATP生成减少又会是膜表面的Ca2+交换体不能发挥作用,这样又能加重 Ca2+的积聚,形成恶性循环。

3.3 加重活性氧的生成 线粒体内 Ca2+超载也可引起线粒体 MPTP的开放,线粒体膜通透性的改变导致了线粒体内外膜电位的降低,从而使电子传递体系和氧化磷酸化发生障碍,终止 ATP生成,大量乳酸堆积产生自由基增加等一系列活性氧的生成[23],加重细胞的继发性损伤。此外,在 ASCI后由兴奋性毒素所造成的损伤会使线粒体摄取大量 Ca2+,从而增加活性氧的生成[24]。钙超载的发生与发展又是许多有害因素导致细胞损伤甚至凋亡的机制。

ASCI的病理机制很复杂,有关线粒体在脊髓继发性损伤机制中的作用主要集中在损伤后线粒体的能量代谢紊乱、钙超载、氧化应激、活性氧的生成等几大方面,同时也和线粒体介导的细胞凋亡有着密切的关系。大量的细胞以凋亡方式死亡,故细胞凋亡被认为是脊髓损伤的继发改变的重要过程。但线粒体功能变化对神经细胞凋亡的影响以及其在神经细胞凋亡信号转导机制中的作用等问题仍有待进一步研究。

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