肝细胞生长因子及其受体与神经纤毛蛋白1在骨肉瘤中的表达及意义

吴同申，孟 彦，彭圣智

（1.济宁医学院附属医院骨科，山东济宁272029；2.山东大学第二医院骨科，济南250033；3.济宁医学院病理学教研室，山东济宁272067）

骨肉瘤临床中常见，患者进展较快，且病变进展与基因和蛋白有密切关系。肝细胞生长因子（HGF）又称为离散因子，可以对肝细胞进行强烈而有效的刺激，引起肝细胞的再生。HGF在作用过程中可以与肝细胞生长因子受体（C-met）结合而发挥生物学作用。而C-met由原癌基因C-met编码表达，C-met是Ⅱ型氨酸激酶受体，正常组织和细胞中表达极少，在恶性肿瘤中表达明显升高［1］。HGF与C-met结合后可以促进多种肿瘤的增殖、迁移和血管的生成，对肿瘤的侵袭和转移有重要促进作用。神经纤毛蛋白1（NRP1）是SEMA3F的受体，其不仅具有促进神经导向因子的生长，而且在肿瘤中的作用受到学者的关注［2］。本实验应用免疫组织化学技术检测骨肉瘤组织中HGF、C-met和NRP1的表达情况，并进行临床对照观察，探讨其临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集济宁医学院附属医院及山东大学第二医院、山东大学齐鲁医院2008年1月至2010年11月骨肉瘤手术后的留取的蜡块及临床资料作为观察组，纳入均符合WHO在2008版中关于骨肉瘤的诊断标准，并重新切片并由病理医师再次确诊，患者术前均未进行放疗和化疗。本组共选取70例，男40例，女30例，年龄11～38岁，平均18.7岁。同时选取经病理证实为正常的成熟骨组织并经脱钙后的蜡块及临床资料50例作为对照组，男26例，女24例，年龄12～36岁，平均17.8岁。2组在一般临床特征中的比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 HGF、C-met和NRP1蛋白的检测 实验用的兔抗人HGF、C-met和NRP1蛋白的浓缩液均购自中杉金桥生物技术公司，HGF、C-met和NRP1蛋白的检测均应用免疫组化二步法，均由病理技师进行操作，设阳性对照和阴性对照，严格质量控制。

1.2.2 HGF、C-met和 NRP1蛋白的判断方法 HGF、C-met和NRP1蛋白阳性染色定位于细胞质和（或）细胞膜上，以出现棕黄的颗粒定为阳性细胞，选择阳性细胞集中的区域（热点区）并计数5个400倍视野的阳性表达细胞数，以平均每高倍镜视野的阳性肿瘤细胞数大于或等于25%即判断为阳性，以小于25%为阴性。计算阳性率。

1.3 统计学处理 应用SAS 6.12统计软件进行分析，应用χ2检验、相关分析及生存分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2 组中HGF、C-met和NRP1蛋白表达阳性率的比较观察组中HGF、C-met和NRP1蛋白表达的阳性率明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 观察组中不同临床特征患者HGF、C-met和NRP1蛋白表达的比较 观察组中HGF、C-met和NRP1蛋白表达的阳性率与肿瘤的转移、脉管浸润、临床分期及Ki67的表达密切相关，见表2。

2.3 观察组中HGF、C-met和NRP1表达的相关性 经线性相关分析显示，观察组中 HGF和 C-met（r＝0.47，P＝0.016 5）、HGF和 NRP1（r＝0.43，P＝0.031 2）、C-met和NRP1（r＝0.48，P＝0.010 9）的表达具有正相关性。

表1 2组中HGF、C-met和NRP1蛋白表达阳性率的比较［n（%）］

表2 观察组中不同临床特征患者HGF、C-met和NRP1蛋白表达的比较［n（%）］

3 讨 论

骨肉瘤在病变进展中增殖明显，且出现明显的浸润和转移。NRP1是细胞表面相对分子质量为102×103的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其常表达在内皮细胞和一些肿瘤细胞中，是Semaphorin3A和血管内皮生长因子（VEGF）的受体，在神经轴突的生长、血管的生成及肿瘤的转移中起重要作用［3］。也有观点认为NRP1表达在所有肿瘤细胞中，即分布在肿瘤血管内皮细胞上，也直接分布在肿瘤细胞中［4］。如果NRP1与VEGF结合，可以有效地促进肿瘤血管的生成及肿瘤细胞的增殖。也有人发现NRP1可以有效地下调肿瘤细胞间的黏附作用，使肿瘤细胞易于脱离原发灶而出现转移［5］。HGF和C-met具有明显的协同作用，其高表达时引起β2连环蛋白的酪氨酸残基发生磷酸化，使其不能与E-钙黏蛋白胞内部分结合形成复合体，破坏了E-钙黏蛋白和细胞骨架的连接作用，最终引起细胞间的黏附作用减弱［6-7］。也有观点认为HGF是通过增加整合素的功能活性，而不是改变其在细胞膜表面的表达量来促进细胞与胞外基质成分的黏附作用［8］。多个学者的研究则显示，HGF／C-met的作用过程中，对肿瘤的淋巴管生成也有重要促进作用［9-10］。因此HGF／C-met的作用可能是多元性的，其影响因素也较多。

研究结果显示，观察组中HGF、C-met和NRP1高表达，提示3种蛋白在肿瘤进展中有明显的促进作用，也显示出HGF、C-met和NRP1作为癌基因起到的类似作用。相关分析显示HGF、C-met和NRP1之间均呈正相关性。由于HGF／C-met被认为是经典的作用通路，而NRP1可以对此通路形成有效的促进作用，因此NRP1对HGF／C-met的表达有明显的增强作用。由于NRP1、HGF／C-met均可以促进以VEGF诱发的血管生成，因此NRP1对 HGF／C-met的作用是否通过VEGF为中介分子尚有待更多实验证实。本研究结果显示，观察组中HGF、C-met和NRP1蛋白表达的阳性率与肿瘤的转移、脉管浸润、临床分期及Ki67的表达密切相关，提示3种蛋白参与了肿瘤的转移、脉管浸润和细胞的增殖过程。由于以上因素均与骨肉瘤的预后有关，因此联合检测 HGF、C-met和NRP1蛋白的表达可能对判断预后有一定价值。即骨肉瘤中HGF、C-met和NRP1高表达患者的预后差。Ki67作为肿瘤细胞恶性增殖的重要指标，而HGF、C-met和NRP1均与Ki67表达的增殖指数有关，因此3种蛋白对肿瘤细胞的增殖也有明显的促进作用，此结论也显示出了HGF、C-met和NRP1高表达时的高增殖的肿瘤细胞，同时显示出了高表达预示着患者的预后不良。

总之，骨肉瘤组织中 HGF、C-met和NRP1高表达，三者可能具有协同正向作用，使肿瘤快速生长、浸润及转移。术后联合检测HGF、C-met和NRP1的表达可能对判断预后有一定价值。

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