PES1在卵巢癌中的表达及其对内皮生长因子的影响

江絮萍，叶 泓

（武警福建总队医院妇产科，福州350003）

Pescadillo基因是在研究逆转录病毒诱发的斑马鱼胚胎发育缺陷中发现的。该基因在酵母、小鼠和人类均有表达，且功能高度保守，分别被命名为 YPH1／Nop7p、Pes1和 PES1［1-3］。Pescadillo主要表达在乳腺、卵巢等细胞分裂旺盛的组织中，能诱导染色质发生大规模伸展，而且能直接诱导下游靶基因表达，表明该分子具有转录因子功能［4-6］。研究表明，PES1在多种肿瘤如乳腺癌、胶质瘤、前列腺癌、胃癌以及头颈部鳞状上皮细胞癌中高表达［4，7-10］。血管内皮生长因子（VEGF）在卵巢癌的发生、发展中起极其重要的作用。因此，本研究初步探讨PES1在卵巢癌中的表达及其与VEGF表达的关系，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 FLAG-PES1和pSliencer 2.1-U6neo载体由本科室构建并保存。293T细胞由本科室保存，采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基于37℃5%CO2孵箱内常规培养。卵巢癌CAOV-3和ES-2细胞培养基同条件培养。FLAG抗体和鼠抗GAPDH购自Sigma公司，抗缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）抗体购自北京中山公司，PES1抗体购自中衫金桥公司。限制性内切酶、DNA连接酶、DNA纯化试剂和Lipofectamine 2000等分别购自美国NEB公司、德国Qiagen公司及美国In-vitrogen公司。VEGF酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自北京邦定公司。含VEGF启动子的荧光素酶报告基因由解放军309医院熊志红研究员惠赠。卵巢癌及癌旁组织取自本科室患者的组织标本。

1.2 方法

1.2.1 组织蛋白的提取 分别取出小块的癌组织或癌旁组织，先用生理盐水洗涤，放入研磨器中加入200μL RIPA（含10g／L NP40，5g／L脱氧胆酸钠，10g／L十二烷基硫酸钠）充分研磨后4℃12 000r／min离心10min取上清液。

1.2.2 蛋白印迹分析 样品蛋白电泳（SDS-PAGE），封闭、洗膜，加到硝酸纤维素膜上压片显影。

1.2.3 细胞转染和转录激活活性的测定 参照文献［11］：将总量为2.0μg的重组质粒DNA与80μL的培养基混合，再将2.5μL脂质体2000与80μL的培养基混合，然后将上述2种溶液混合，室温放置20min，加入到含有800μL培养液和10%胎牛血清的12孔板中。各组同时转染0.2μg含VEGF启动子的荧光素酶报告基因和0.1μg表达半乳糖苷酶的质粒。每组检测3个复孔，作用24h后分别测定各组的转录激活活性，取平均值，计算各组与空白对照组的转录激活活性的比值为相对值。

1.2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测VEGF的分泌量每组细胞接种2×105个，细胞贴壁后，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗2次，加入不含血清的培养液培育24h，收集相应细胞的培养液，按照人VEGF ELISA试剂盒说明书进行检测，每组重复3次。

1.2.5 荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测VEGF的相对mRNA表达 总RNA用Trizol试剂提取后，按一步法RTPCR试剂盒说明进行。VEGF的上游引物为5′-TCT ACC TCC ACC ATG CCA AGT-3′，下游引物为5′-GAT GAT TCT GCC CTC CTC CTT-3′；β-actin上游引物为5′-TCA AGA TCA-TTG CTC CTC CTG-3′，下游引物为5′-CTG CTT GCT GAT CCA CAT CTG-3′。循环条件为：50 ℃ 10min，95 ℃5min为1个循环，再95℃10s，60℃30s，72℃30s，共40循环。扩增结果与β-actin进行比较作为VEGF的相对mRNA表达水平，每组实验重复3次。

1.2.6 HIF-1αSiRNA SiRNA表达载体的构建参照文献［12］。siRNA正义链为5′-AGT TAG TTC AAA CTG AGT TAA TCC C-3′；反义链为 5′-GGG ATT AAC TCA-GTT TGA ACT AAC T-3′。构建好的SiRNA表达载体用Lipofectamine 2000转染细胞。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0进行统计学分析，计量资料用±s表示，组间比较行t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

图1 PES1在卵巢癌组织中的表达

2.1 PES1在卵巢癌组织中的表达 为阐明PES1与卵巢癌的相关性，提取了4例不同卵巢癌患者的肿瘤组织及其对应的癌旁组织蛋白，蛋白印迹检测结果显示，肿瘤组织中PES1的表达水平明显高于相应的癌旁组织（图1）。

2.2 过表达PES1对卵巢癌细胞中HIF-α表达和VEGF分泌的影响 由于VEGF表达在卵巢癌的发生、发展过程中起极其重要的作用，而PES1具有转录因子功能，因此，观察PES1是否能调节VEGF的表达。将FLAG-PES1瞬时转染上皮性卵巢癌CAOV-3和ES-2细胞24h后，取细胞培养液用ELISA检测其中VEGF的分泌量发现，转染PES1的CAOV-3和ES-2细胞培养液的 VEGF分泌量分别由（178.0±11.8）pg／mL和（309.5±18.5）pg／mL 上升到 （375.0±18.3）pg／mL 和（633.2±25.7）pg／mL，这2种细胞的VEGF分泌量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。RT-PCR结果表明，转染PES1的CAOV-3和ES-2细胞的VEGF相对mRNA水平分别上升了约1.8倍和2倍，差异有统计学意义（P＜0.01）。结果表明，PES1可以增强CAOV-3和ES-2细胞中VEGF的表达。由于VEGF是HIF-1α的直接靶基因，因此，进一步观察过表达PES1是否升高HIF-1α表达。蛋白印迹结果表明PES1表达能升高这两种细胞中HIF-1α的表达（图2）。

2.3 PES1对含VEGF启动子的荧光素酶报告基因的转录激活活性的影响 由于PES1具有转录调节功能，因此，需要观察PES1是否能直接调节VEGF的转录。将不同剂量的FLAG-PES1与含VEGF启动子的荧光素酶报告基因共转染293T细胞后，检测报告基因的转录激活活性，发现加入不同剂量的PES1与没有加入PES1的转录激活活性相比，差异无统计学意义（P＞0.05），说明PES1对调节VEGF的转录没有直接影响。

图2 PES1对CAOV-3和ES-2细胞中VEGF表达的影响

2.4 PES1升高VEGF的表达依赖于HIF-1α 将构建好的HIF-1αSiRNA或空载体转染CAOV-3细胞后，发现转染HIF-1αSiRNA的CAOV-3细胞中HIF-1α的表达明显降低，说明所构建的HIF-1αSiRNA能有效地抑制HIF-1α表达。将HIF-1αSiRNA与FLAG-PES1共转染CAOV-3和ES-2细胞后，蛋白印迹结果表明，HIF-1αSiRNA明显抑制PES1引起的HIF-1α表达升高，而且VEGF的蛋白分泌量和mRNA水平也被明显抑制，说明PES1升高VEGF的表达依赖于HIF-1α（图3、4）。

图3 HIF-1αSiRNA对PES1引起的VEGF分泌的影响

图4 HIF-1αSiRNA对PES1引起的VEGF相对mRNA水平的影响

3 讨 论

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，病死率居妇科恶性肿瘤首位。由于卵巢位于盆腔深部，难以早期筛查，缺乏早期诊断方法，多数患者确诊时已处于晚期，预后差，长期以来人们一直为找到敏感的肿瘤标志物而努力。目前，卵巢癌发生的分子机制并不十分清楚，因此，进一步揭示卵巢癌发生、发展的分子机制，对指导卵巢癌的诊断和治疗具有重要的指导意义。

Pescadillo在细胞增殖和细胞周期进程中起着极其重要的作用。在哺乳动物中，PES1与上游结合因子（upstream binding factor，UBF1）一起在核糖体生物合成中起重要的作用，PES1是核糖体生物合成所必需的，PES1突变或缺陷会导致细胞周期阻滞［13-14］。PES1在许多肿瘤细胞中过量表达。研究表明，外源性Pescadillo表达能够转化人、鼠的成纤维细胞，使其在软琼脂中发生、非依赖性生长［15］。雌激素能诱导乳腺癌细胞中PES1的表达，而且PES1在乳腺癌细胞中高表达；PES1会引起细胞周期蛋白D1表达降低，而周期素依赖性蛋白激酶抑制剂p27升高，从而抑制乳腺癌细胞增殖和致瘤性［4，16］。这些表明PES1与细胞的转化、恶变密切相关，可能参与肿瘤的发生、发展。本研究的结果表明，PES1在卵巢癌组织比在癌旁组织中表达明显升高，提示PES1可能在卵巢癌的发生、发展过程中起重要的作用。

活跃的血管生成是实体肿瘤生长和转移过程中普遍存在的病理现象，VEGF是重要的血管生成因子。在肿瘤的发生过程中，其增生速度超过血管生成的速度而造成局部缺氧。HIF-1α是缺氧状态下在细胞内的一种转录因子，其靶基因涉及肿瘤细胞能量代谢、血管生成、肿瘤转移和离子代谢等，在肿瘤发生、发展中的作用逐渐被重视。VEGF是HIF-1α直接调节的下游靶基因。VEGF和HIF-1α在卵巢癌组织表达明显升高，并在其发生、发展、转移等过程中起极其重要的作用。由于90%以上的卵巢癌起源于卵巢上皮细胞，因此，本研究用上皮性卵巢癌细胞CAOV-3和ES-2进行实验。结果表明，过表达PES1可以明显升高CAOV-3和ES-2细胞的VEGF分泌及其mRNA水平，可以升高VEGF的表达，同时PES1增强HIF-1α的表达。但报告基因的转录活性检测说明，PES1不能直接调节VEGF的转录。将HIF-1αSiRNA与PES1共转染细胞后，发现HIF-1αSiRNA能明显抑制PES1诱导的VEGF分泌升高以及其mRNA水平的升高。说明PES1能通过HIF-1α通路升高VEGF的表达。但是HIF-1αSiRNA没有完全抑制PES1诱导的VEGF表达升高，说明PES1可能还通过其他途径影响VEGF的表达。有研究表明，雌激素受体（ER）可以调节VEGF的表达，PES1可以与ER相互作用并调节其下游基因的表达［17-18］。因此，PES1可 能 通过 HIF-1α途 径 影 响VEGF的表达，当然这需要进一步的实验研究证明。

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