伊洛马司他联合卡培他滨对人喉癌hep-2细胞的影响＊

李 黎，张少容，熊辉强，高树峰，兰 宁

（南昌大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科 330006）

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一类Zn2＋依赖的蛋白水解酶，参与细胞外基质的降解与组织重塑，可降解基底膜从而促进喉癌细胞的侵袭和转移。伊洛马司他是羟肟家族中一种有效的基质金属蛋白酶抑制剂（matrix metallo-proteinase inhibitors，MMPI），其与存在于所有蛋白酶中的Zn原子的活性中心相结合，从而抑制MMP的活性，进一步抑制喉癌的侵袭与转移［1-2］。本实验通过伊洛马司他、化疗药物卡培他滨两药单独和联合处理喉癌hep-2细胞，观察其对hep-2细胞的影响，并探讨伊洛马司他在抗肿瘤过程中的具体作用机制，为喉癌的联合化疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）试剂：RPMI1640培养基购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；胰酶，北京索莱宝科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购自北京索莱宝科技有限公司；MTT购自Sigma公司；RT-PCR试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；PI／annexinV凋亡盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；卡培他滨，大连美伦医药科技发展有限公司；伊洛马司他购自美国Santa Cruz公司。（2）细胞株：人喉癌细胞株hep-2，购于南京凯基生物科技发展有限公司。将细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养，其中青霉素、链霉素各100μ／mL，长满后用0.25%胰酶消化传代。（3）引物：根据prime 5.0软件设计引物，由金斯瑞生物科技有限公司合成。MMP-9引物（362bp）的上游序列为5′-CGG CAC CTC TAT GGT CCT C-3′，下游序列为 5′-CAC TTG TCG GCG ATA AGG AA-3′。内参引物β-actin（434bp）上游序列为5′-CGG GAA ATC GTG CGT GAC-3′，下游序列为5′-TGG AAG GTG GAC AGC GAG G-3′。

1.2 甲基偶氮唑盐（MTT）法检测hep-2细胞的抑制率 取处于对数生长期的hep-2细胞，制成单细胞悬液，调整细胞数为7.5×104／mL接种于96孔细胞板，每孔100μL，待细胞贴壁后加药。伊洛马司他单独作用组给予含伊洛马司他浓度分别为2.5、5、10、20、40μg／mL的培养液100μL；卡培他滨单独作用组给予含卡培他滨浓度分别为50、100、200、400、800μg／mL的培养液100μL，同时设立DMSO的阴性对照组、1640培养基空白对照组。每组每个浓度下设5个复孔，培养24h后，每孔加入20μL的 MTT（5mg／mL），孵育4h后，弃上清液，加入DMSO，终止反应。微振荡5min后，于酶标仪波长490 nm处测吸光度（A）。以上各组实验重复3次。抑制率（%）＝（1-治疗组A值／对照组A值）×100%。用SPSS13.0软件求出IC10及IC50值。

MTT联合用药实验选用两个浓度组：（1）两种药物的IC10浓度组（即8μg／mL伊洛马司他＋100μg／mL卡培他滨），该浓度组细分为3组，伊洛马司他＋卡培他滨联合浓度（8＋0）μg／mL组、伊洛马司他＋卡培他滨联合浓度（100＋0）μg／mL组，伊洛马司他＋卡培他滨联合浓度（8＋100）μg／mL组。（2）2种药物较接近半数抑制度（IC50）且小于IC50的浓度组（40 μg／mL伊洛马司他＋400μg／mL卡培他滨），同（1）中方法细分为3组。实验方法同前计算出各组的抑制率。采用Q值判断伊洛马司他和卡培他滨联合用药的性质。Q＝Ea＋b／（Ea＋Eb-Ea＊Eb）。公式中Ea代表单药A的抑制率，Eb代表单药B的抑制率，Ea＋b代表两药联用的抑制率。Q＞1.15为两药协同作用，0.85≤Q≤1.15为相加作用，Q＜0.85为拮抗作用。实验测得的IC10供后续实验使用。

1.3 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测hep-2细胞 MMP-9mRNA表达的变化 取对数生长期的hep-2细胞，以每孔5×104的密度接种于6孔细胞培养板，待细胞铺满后加药，分为4组：（1）伊洛马司他组（8μg／mL）；（2）卡培他滨组（100μg／mL）；（3）联合用药组（8μg／mL伊洛马司他＋100μg／mL卡培他滨）；（4）对照组（未用药）。培养24后弃上清液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两遍，按Trizol试剂盒操作说明书提取细胞总RNA，并对RNA定量测定。取4μg总RNA为模板，按HiFi-MMLV cDNA第1链合成试剂盒操作说明书操作，将RNA逆转录成cDNA。以3μL cDNA为模板，进行扩增，扩增条件为：94℃变性45s，60.5℃退火60s，72 ℃延伸60s，35个循环。PCR扩增产物行1.0%琼脂糖凝胶电泳，通过Bandleader软件分析各条带，以目的基因荧光亮度／β-actin荧光亮度表示PCR产物含量。实验重复3次，取平均值作为实验结果。

1.4 流式细胞仪检测hep-2细胞的凋亡 取对数生长期的hep-2取对数生长期的hep-2细胞，同前药物分组处理hep-2细胞，24h后按PI／AnnexinV-FITC试剂盒操作标记细胞和流式细胞术检测细胞凋亡，每组重复3次。细胞凋亡比率A1按以下公式计算：A1（%）＝亚二倍峰细胞数／细胞总数×100%。

1.5 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料用±s表示，MTT单药组内采用单因素方差分析加最小显著差（least significant difference，LSD）法两两比较各浓度的抑制率，MTT联合实验采用t检验。RT-PCR与流式细胞术组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞生长抑制 MTT法检测各组细胞生长抑制情况，结果表明，hep-2细胞经不同浓度伊洛马司他、卡培他滨单独处理24h后，细胞生长程度受到不同程度的抑制（表1、2），且抑制程度依赖于药物剂量的增加，不同浓度抑制率间的差异有统计学意义（伊洛马司他组F＝144.167，P＜0.05；卡培他滨组F＝60.131，P＜0.05）。进一步LSD法两两比较各浓度的抑制率，伊洛马司他组中任意浓度间差异均有统计学意义（P＜0.05），卡培他滨组中任意两浓度间差异也均有统计学意义（P＜0.05）。经SPSS软件求得伊洛马司他的10%的细胞抑制浓度（IC10）和IC50分别为8μg／mL和130μg／mL，卡培他滨的IC10与IC50分别为100μg／mL和910μg／mL。在联合用药实验中采用t检验比较，伊洛马司他＋卡培他滨联合浓度（8±100）μg／mL的抑制率明显高于浓度（8±0）μg／mL和浓度（0±100）μg／mL，且差异均有统计学意义（t＝8.421，P＜0.05；t＝7.009，P＜0.05）；联合浓度（40±400）μg／mL的抑制率也明显高于浓度（40±0）μg／mL和（0±400）μg／mL，差异均具有统计学意义（t＝10.226，P＜0.05；t＝8.879，P＜0.05）。伊洛马司他＋卡培他滨联合浓度（8±100）μg／mL组Q值为1.45，为协同作用；浓度（40±400）μg／mL组 Q值为1.05，为相加作用。

表1 伊洛马司他对hep-2细胞的增殖抑制情况（±s）

表1 伊洛马司他对hep-2细胞的增殖抑制情况（±s）

伊洛马司他用药浓度（μg／mL） A值 抑制率（%）2.5 1.154±0.004 2.85±0.34 5.0 1.112±0.005 6.42±0.44 10.0 1.076±0.006 9.34±0.61 20.0 1.012±0.016 14.67±1.53 40.0 0.823±0.039 30.67±3.05

表2 卡培他滨对hep-2细胞的增殖抑制抑制情况（±s）

表2 卡培他滨对hep-2细胞的增殖抑制抑制情况（±s）

卡培他滨用药浓度（μg／mL） A值 抑制率（%）50 0.177±0.002 3.24±0.96 100 0.166±0.004 9.31±1.88 200 0.134±0.005 27.08±3.12 400 0.118±0.004 35.54±2.50 800 0.107±0.004 41.56±1.93

2.2 RT-PCR检测各组hep-2细胞MMP-9mRNA表达的变化 RT-PCR结果表明，各组均检测到MMP-9的表达。半定量行t检验显示，卡培他滨与正常组相比，MMP-9的表达差异无统计学意义（t＝2.570，P＞0.05）；伊洛马司他组与联合用药组的MMP-9mRNA的表达水平均低于正常组，且差异有统计学意义（P＜0.05）；并且联合用药组 MMP-9mRNA的表达水平低于伊洛马司他组，差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组为0.557±0.017，伊洛马司他组为0.484±0.021，卡培他滨组为0.530±0.006，联合用药组为0.369±0.002。

2.3 流式细胞术检测各组hep-2细胞凋亡率的变化 hep-2细胞凋亡率对照组为（9.47±0.81）%，伊洛马司他组为（14.44±1.09）%，卡培他滨组为（16.33±1.20）%，联合用药组为（23.47±1.16）%。经t检验实验结果显示，伊洛马司他组和卡培他滨组处理hep-2细胞24h后，凋亡率均高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；联合用药组处理hep-2细胞24h后，凋亡率高于其他各组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

喉癌是头颈部常见恶性肿瘤，浸润和转移是喉癌的主要的生物学特性，也是喉癌患者死亡的主要原因。细胞外基质（ECM）和基底膜（BM）的降解是肿瘤侵袭和转移的首要环节，MMPs几乎能降解ECM中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，因此在肿瘤侵袭、转移中起关键性作用。而现在喉癌中研究最多最广的是Ⅳ型胶原酶（MMP-9和MMP-2）。MMP-9属于明胶酶类，它可降解BM的主要成分胶原Ⅳ，其能与整合素结合从而促进肿瘤细胞的生长，调节肿瘤细胞黏附性和运动能力；也能促进肿瘤细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF）加速肿瘤转移［3-4］。最新研究还发现，MMP-9可切割蛋白酶连接蛋白-1（PN-1）来调控肿瘤的转移［5］。MMPIs是当前抗肿瘤药物中很有发展前景的一类，从来源可分为天然和人工合成两大类。组织基质金属蛋白酶抑制剂（Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs）是MMPs的天然抑制剂，其和MMPs的表达不平衡在喉癌的浸润和转移过程中起重要作用［6］。合成的MMPIs主要是设计来抑制肿瘤细胞产生的MMPs的致瘤潜能，目前主要有马立马司他，BAY129566，伊洛马司他等。

有关基质金属蛋白酶及其抑制剂在肿瘤中的研究在国内外已见较多报道，例如Sun等［7］研究发现，由病毒介导的RNA干扰MMP-9基因沉默可以抑制喉鳞状细胞癌浸润和生长；李为等［8］认为TIMP-1的表达和肿瘤的发生具有明显的负相关性；Almholt等［9］也发现采用伊洛马司他（GM6001）处理的乳腺癌MMTV-PyMT转基因小鼠与安慰剂处理的小鼠相比，乳腺癌的平均转移量减少了至少10倍。

化疗药物卡培他滨是一种氟尿嘧啶氨甲酸酯类药物，它是氟尿嘧啶（5-FU）的前体，口服后以完整药物形式经肠黏膜进入肝脏，并转化为细胞毒性成分5-FU，起到靶向性杀伤肿瘤细胞作用，具有高效、低毒的特点［10］，其存在的问题是单药卡培他滨在治疗癌症时的效果并不太满意。

在本实验中使用人工合成MMPIs伊洛马司他、卡培他滨单独和联合处理喉癌hep-2细胞。伊洛马司他又名GM6001，一种羧氨酸修饰的二肽，可抑制 MMP-1，-2，-3，-8，-9的活性［2，11］。它不但能可逆性结合蛋白酶中含锌离子的活性区，直接抑制蛋白酶的活性，还可抑制MMPs前体转化为有活性的MMPs，从而抑制肿瘤的浸润与转移。实验结果显示伊洛马司他和卡培他滨单独用药24h后都可抑制喉癌hep-2细胞的生长，且呈现浓度依赖性。当伊洛马司他药物浓度从2.5μg／mL成倍增加至40μg／mL时，它对hep-2细胞的抑制率逐渐增加，此药的IC10与IC50分别为8μg／mL和130μg／mL；化疗药物卡培他滨药物剂量从50μg／mL成倍增加至800μg／mL时，它对hep-2细胞的抑制率也随之增加，此药物的IC10与IC50分别为100μg／mL和910μg／mL。在伊洛马司他联合卡培他滨用药24h后发现，其对hep-2细胞的抑制率在相同剂量下明显高于两种药物单独用药24h，且伊洛马司他与卡培他滨联合用药（8＋100）μg／mL浓度组中两药为协同作用，（40＋400）μg／mL浓度组中为相加作用，这说明伊洛马司他联合卡培他滨对hep-2细胞的抑制效应强于二者单独用药，且在低浓度时具有协同作用。同时，作者使用流式细胞术检测喉癌hep-2细胞的凋亡，为避免非凋亡性杀伤的细胞太多造成流式细胞仪检测碎片太多，作者选取两种药物的IC10浓度进行检测，作用24h后显示伊洛马司他和卡培他滨单独用药都可诱导hep-2的凋亡过程，两种药物联合作用后，hep-2细胞凋亡的程度明显增加。这表明，伊洛马司他不但可以抑制hep-2细胞的增殖，还可诱导其凋亡，从而抑制喉癌的发生、发展；并且伊洛马司他联合卡培他滨用药对hep-2细胞的影响明显优于其单独用药。

此外，本研究中采用RT-PCR检测喉癌hep-2细胞中MMP-9mRNA表达水平，发现MMP-9mRNA在hep-2细胞中表达阳性，当伊洛马司他IC10浓度单独用药24h后，hep-2细胞中MMP-9mRNA的表达水平下降。兰菁等［12］在宫颈癌HCE1多细胞球体浸润人脐静脉内皮单层细胞模型中得到与本实验类似的结果，GM6001干预后的宫颈鳞癌HCE1多细胞球体MMP-9的表达明显降低。这表明伊洛马司他对hep-2细胞的生长抑制、诱导细胞凋亡作用以及联合卡培他滨用药的作用，可能与下调MMP-9mRNA的表达，抑制 MMP-9的活性有关。本实验还发现卡培他滨不能降低MMP-9mRNA的表达水平，但当两种药物在IC10浓度联合作用时，MMP-9mRNA的表达水平不仅明显低于对照组，且低于伊洛马司他单独用药组，提示卡培他滨虽然对MMP-9mRNA的表达水平没有影响，但很有可能可促进伊洛马司他对MMP-9mRNA活性的抑制作用，这也进一步说明两药物在IC10浓度联合作用时具有协同作用。

综上所述，伊洛马司他与卡培他滨联合用药可明显增强单药对喉癌hep-2细胞的抑制效应和诱导细胞凋亡作用，同时推测伊洛马司他的作用机制可能是下调MMP-9的表达水平，从而抑制喉癌的浸润和转移。这些都提示MMPI伊洛马司他有可能作为临床化疗药物良好的辅助药物，为喉癌和其他恶性肿瘤的联合药物治疗提供了一定的实验依据。但是，伊洛马司他和卡培他滨联合应用的不良反应是否减少，最为适合的配比剂量，在临床上实现的可能性还有待进一步实验研究。

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