维生素D受体基因多态性与吸烟因素交互作用对非小细胞肺癌发生的影响

杨雁鸿 周文文 唐利娟 齐曦明 侯燕燕 才丽娜 潘福栋 彭 勇

(秦皇岛市第一医院肿瘤内科，河北 秦皇岛 066000)

研究结果表明，内在的遗传因素在环境因素的联合作用下影响肺癌的发生。维生素D受体(VDR)基因多态性与癌症的发生有着密切联系〔1〕。VDR是介导1，25(OH)2D3发挥生物效应的核内生物大分子，为类固醇激素、甲状腺激素受体超家族成员。维生素D在正常肺组织内的抑制细胞生长、促进细胞分化的作用，这种功能受转录调节因子——VDR的调节。1，25(OH)2D3活性维生素D在体内具有多方面的活性，是维持钙、磷平衡和骨代谢的主要激素之一。除此之外，1，25(OH)2D3在肿瘤的预防和治疗方面也具有重要作用〔2～4〕。许多体内、体外实验都证实了1，25(OH)2D3对肺癌的抑制作用〔5〕。VDR与肺癌相关性的研究目前国内尚未见报道。检测的VDR基因多态性酶切位点分别为Apa1、Bsm1、Fok1和Taq1。本文探索VDR基因多态性酶切位点Apa1、Bsm1和Taq1与吸烟因素的单独作用及两者间交互作用，对非小细胞肺癌(NSCLC)发生的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2010年10月至2012年10月我院住院NSCLC患者144例为NSCLC组。其中鳞状细胞癌66例、腺癌72例、腺鳞癌、大细胞癌及未分类癌共6例。其中男90例，女54例，年龄57～70岁，平均65.4岁，吸烟105例;对照组142例为健康体检者，男92例，女50例，年龄55～74岁，平均66.0岁，吸烟71例。所有患者经病理学确诊为原发性肺癌，无肺癌家族史和职业致癌物接触史。两组年龄、性别构成上均衡可比。根据Zhao等〔6〕研究将吸烟个体定义为吸烟或曾经吸烟大于100支以上。

1.2 研究方法 外周血DNA分离试剂盒，TaqDNA聚合酶及其缓冲液，4dNTPs，Apa1、Bsm1和 Taq1限制性内切酶，MarkerⅠDNA及ladder DL2000 Marker是Solarbio及天根生化科技有限公司产品。引物序列根据基因库公布的VDR基因序列，并采用DNAman程序设计，由北京鼎国昌盛生物公司合成。根据酶切结果选取各个位点不同基因型的PCR产物进行测序(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，以验证扩增产物为目的片段并且确定基因型。

基因DNA取自外周血，采用外周血DNA分离试剂盒提取。Apa1位点PCR反应体系总量为25 μl，Bsm1位点PCR反应体系总量为 20 μl，Taq1 位点 PCR 反应体系总量为 25 μl，包含有基因组 DNA、引物 TaqDNA聚合酶缓冲液及0.5 μl的TaqDNA聚合酶。Apa1的上游引物为5'-AGGTCGGCTAGCTTCTGGATCATC-3'，下 游 引 物 为 5'-AGATCCTAAATGCACGGAGAAGTC-3'。Taq1的上游引物为5'-AGGTCGGCTAGCTTCTGGATCATC-3'，下 游 引 物 为 5'-AGATCCTAAATGCACGGAGAAGTC-3'。其反应条件如下:预变性 95℃ 5 min，变性94℃ 30 s，退火52℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，共计35个循环。最后，一个循环为72℃10 min延伸。

Bsm1的上游引物5'-GGACCTGTGGCAACCAAGACT-3'，下游引物为5'-GCCCGCAAGAAACCTCAAATA-3'。通过编好程序的PCR仪进行PCR扩增，其循环条件如下:Bsm1位点PCR反应条件为预变性94℃ 5 min，变性94℃ 30 s，退火57℃ 40 s，延伸72℃ 50 s，共计30个循环。最后，一个循环为72℃ 5 min延伸。各目的片段产物加入对应的限制性内切酶5 μl及其缓冲液，其产物在65℃恒温箱16 h，然后对酶切产物电泳。

1.3 结果判断 目的片段产物经Bsm1或Taq1酶切后电泳条带可能出现3种情况:等位基因没有酶切位点的纯合子出现1个条带，分别以两个相应内切酶的第一个大写字母表示其基因型，即分别表示为AA、BB或TT，只有一个酶切位点的杂合子出现3个条带，分别以相应的大小写字母表示其基因型，即Aa、Bb或Tt;有两个酶切位点的纯合子出现2个条带，分别表示为aa、bb 或 tt。

1.4 统计学方法 采用SAS9.0软件进行χ2检验和非条件Logistic回归分析。

2 结果

2.1 酶切后电泳结果 Apa1、Bsm1和Taq1的各基因型的条带数目及位置见图1。

2.2 VDR基因型分布 Bsm1位点两组bb、Bb基因型频率分布差异不显著(P＞0.05)。两组的b、B等位基因频率无差异(P＞0.05)。Apa1位点，两组aa、Aa、AA基因型频率分布差异显著(P=0.032)。以Aa+AA基因型做参照，携带aa基因型可增加吸烟人群NSCLC的发病风险。两组的a、A等位基因频率差异显著(P=0.009)，且与携带等位基因A相比携带等位基因a的个体可增加吸烟人群NSCLC的发病风险。Taq1位点，两组tt、Ft、TT基因型频率分布差异不显著(P＞0.05)。两组的t、T等位基因频率差异不显著(P=0.191)。见表2。

表1 两组VDR的Apa1、Bsm1及Taq1基因多态性分布(n)

表2 两组吸烟人群VDR基因3个位点基因型及等位基因的频率分布〔n(%)〕

图1 VDR-PCR产物经Apa1、Bsm1和Taq1酶切后的电泳图

3 讨论

预计于2015年我国将成为全球肺癌发病率最高的国家〔7〕。虽然有研究显示，年龄不是肺癌的独立预后因素〔8〕，但由于老年人各脏器功能减退，治疗并发症的发生常使老年人不能顺利完成治疗或放弃治疗，从而影响老年肺癌患者的生存期。多项研究表明肺癌的发生是由环境暴露和个体的遗传因素的相互作用而导致的多因素多阶段的恶性疾病。致癌物在不同个体的活性差异可以达数十倍，个体的遗传因素是一个重要原因〔1〕。

1，25(OH)2D3通过VDR介导发挥生物学效应，而VDR几乎表达于所有的组织细胞。有资料表明，在肺癌细胞高表达的VDR与提高生存率有关〔9〕。有关肺癌组织和肺癌前病变VDR表达的实验数据显示，VDR在60%肺正常组织和61%肺化生组织中呈中-高度核表达。在肺癌组织中，VDR核表达为79%，62%的细胞质缺乏表达〔10〕。另外，一项关于人类癌症的初步研究，应用免疫荧光技术测量VDR的表达，发现当正常细胞发生恶变时，VDR的表达数量也在发生改变，由此推测这一变化可以作为预测疾病发生的标志〔11〕。

Dogan等〔12〕发现降低VDR活性的Taq1多态性基因可能是患肺癌的危险因素，而年龄、性别、吸烟可能加重这一因素的影响。秦皇岛位于中国河北省东北部，为暖温带半湿润大陆性季风气候有关，可能与研究对象种族差异、接触致癌因素差异、环境暴露因素及未知的混杂因素有关。有必要在其他人群中重复实验以及进一步扩大样本量验证实验结果。

1 Jones PA，Baylin SB.The epigenomics of cancer〔J〕.Cell，2007;128(23):683-92.

2 Bouillon R，Eelen G，Verlinden L，et al.Vitamin D and cancer〔J〕.Steroid Biochem Mol Biol，2006;102:156-62.

3 Krishnan AV，Trump DL，Johnson CS，et al.The role of vitamin D in cancer prevention and treatment〔J〕.Endocrinol Metab Clin North Am，2010;39(2):401-18.

4 Davis CD，Milner JA.Nutrigenomics，Vitamin D and cancer prevention〔J〕.J Nutrigenet Nutrigenomics，2011;4:1-11.

5 陈佳琦，张 力.维生素D对肺癌的抑制作用〔J〕.国际呼吸杂志，2010;30(22):1375-9.

6 Zhao D，Zhang XE，Guo YL，et al.Cyclooxygenase-2 Gly587Arg variant is associated with differential enzymatic activity and risk of esophageal squamous-cell carcinoma〔J〕.Mol Carcinog，2009;48(10):934-41.

7 中国抗癌协会肺癌专业委员会.2010中国肺癌临床指南〔J〕.北京:人民卫生出版社，2010:7.

8 Meriggi F，Zaniboni A.Non-small-cell lung cancer in the elderly〔J〕.Crit Rev Oncol Hematol，2006;57(2):183-90.

9 Srinivasan M，Parwani AV，Hershberge PA，et al.Nuclear vitamin D receptor expression is associated with improved survival in non-small cell lung cancer〔J〕.J Steroid Biochem Mol Biol，2011;123(1-2):30-6.

10 Menezes RJ，Cheney RT，Husain A，et al.Vitamin D receptor expression in normal，premalignant，and malignant human lung tissue〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2008;17(5):1104-10.

11 Sandgren M，Danforth L，Plasse TF，et al.1，25-Dihydroxyvitamin D3 receptors in human carcinomas:a pilot study〔J〕.Cancer Res，1991;51:2021-4.

12 Dogan I，Onen HI，Yurdakul AS，et al.Polymorphisms in the vitamin D receptor gene and risk of lung cancer〔J〕.Med Sci Monit，2009;15:BR232-42.