氧化应激与阿尔茨海默病

赵 虹 骆庆和 殷 明 赵文娟 (上海交通大学药学院，上海 200240)

阿尔茨海默(AD)患者的迅速增加是当前社会面临的巨大挑战，故对AD病理机制的研究及开发有效的治疗方法已成为了目前神经退行性疾病研究的热点和重点。AD主要病理特征为大脑萎缩，在脑膜、大脑皮层及海马的血管壁内见有β淀粉样蛋白(Aβ)沉积形成的老年斑(SP)〔1〕、神经纤维缠结(NFTs)及神经元丢失〔2〕。大量研究表明，Aβ沉积和tau蛋白的NFTs在AD发病中起关键作用。海马和大脑皮层区细胞外Aβ的聚集及细胞内高磷酸化tau蛋白的神经纤维样缠结，导致神经元细胞的死亡，从而引发病人渐进性认知障碍及记忆丧失。神经元的丧失主要见于额，顶，大脑皮层。此处神经元的丧失导致乙酰胆碱含量减少和胆碱乙酰化活性的减低，导致出现记忆和认知功能障碍等临床表现〔3〕。AD的病因和病理生理机制十分复杂，受基因调控和多种环境因素影响，目前AD的发病机制尚不能完全阐明，也无有效治疗方法。关于AD有许多假说，包括胆碱能假说，amyloid级联反应，氧化应激学说等等。氧化应激与AD有着密切的关系，AD的病因学中，其理论之一就是氧化应激学说。所以本文主要针对AD的氧化应激学说，阐述氧化应激与AD的病理特征关系以及可能的作用，并提出关于氧化应激的一些指标的评价指标，从而对氧化应激以及AD有更深的了解。

1 氧化应激与自由基

氧化应激(OS)的概念最早源于人类对衰老的认识。1956年，英国学者Harmna首次提出自由基衰老学说，该学说认为自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因。1990年，美国衰老研究权威Sohal教授指出了自由基衰老学说的种种缺陷，并首先提出了氧化应激的概念。

自由基在某些生理生化过程发挥作用，在生理状态下的自由基能够刺激细胞生长。但是当自由基的产生和清除的平衡状态被破坏，导致自由基大量聚集，浓度过高会引起人体脂质过氧化以及蛋白质变性，从而对机体造成氧化损伤，形成各种不良结果，对人体造成危害〔4〕。

人体的脑组织是机体负荷氧最多的器官之一。虽然大脑的重量只占据人体体重的2% ～3%，但是消耗了供应机体的20%的氧〔5〕。大脑神经元的谷胱甘肽含量较少，而且只含有中等量的抗氧化酶，清除自由基的能力相对较弱〔6〕;大脑的神经元的膜结构是由高浓度的不饱和脂肪酸组成的，极易被氧化。此外，血脑屏障的存在阻碍了部分抗氧化物质，使其不容易透过，因而使得人脑对氧化应激特别敏感〔7〕。氧是人类生存必需的元素，但如果体内氧化还原平衡遭到破坏，多余的氧自由基会对身体造成氧化损伤，此类氧化损伤直接参与了老年痴呆症等多种神经退行性疾病的病理过程。

2 OS与AD的病理特征

2.1 Aβ与OS效应 Aβ是SP的主要成分，是由β-淀粉样多肽聚集于神经轴突而形成。β淀粉样多肽来源于一种跨膜蛋白-淀粉样前体蛋白，非聚集的β淀粉样多肽对人体没有损伤作用，但是当它形成富集状态之后，便会产生神经毒性和血管内皮毒性，能够诱导OS。近年研究发现，Aβ的毒性作用与自由基有关，OS参与了Aβ致神经毒性的调节〔8〕。

Aβ神经毒性可以造成细胞膜损伤。Aβ诱导 OS，产生ROS，引起细胞膜上不饱和脂肪酸的过氧化，产生过氧化物质，如丙二醛等。这些过氧化脂质体能够进一步破坏膜蛋白的功能。最直接反应在过氧化脂质体能够改变细胞膜上磷脂的结构，从而改变了细胞膜的流动性。

2.2 tau蛋白的氧化磷酸化与OS效应 NFTS是AD最主要的病理特征之一，它主要是由tau蛋白氧化磷酸化所形成〔9〕。tau蛋白是一种微管组织相关蛋白，它与微管结合的能力会由于高度磷酸化而消失，从而形成神经纤维缠结导致神经元功能的丧失。而OS与tau的高度磷酸化有密切联系。ROS能够使钙稳态失调，钙离子大量内流使钙离子依赖性蛋白激酶以及钙调蛋白激酶过度活化，造成蛋白磷酸酶与蛋白激酶的比例失衡，从而促进tau蛋白异常磷酸化〔10〕。此外，ROS也可以通过抑制能量代谢使糖原合成激酶-3(GSK-3)代偿性激活，而tau蛋白激酶(TPK)是GSK-3的异构体，从而也促进了tau蛋白的磷酸化〔11〕。

3 OS状态的表征

在生理条件下，ROS主要来源于线粒体内的氧化磷酸化〔12〕。自由基的产生会对机体的脂质，蛋白，DNA等生物大分子造成氧化损伤，因此生物体内OS代谢产物的检测，对于OS状态的表征具有极大的意义。

机体代谢过程中，ROS不断通过非酶促反应和酶促反应产生，但在抗氧化酶以及外源性和内源性抗氧化剂的协同作用下被不断清除，自由基的产生与消除处于动态平衡过程，可以维持在一个正常的水平之下。细胞内氧化还原平衡是受到严格控制的，即便在老年痴呆症的病态环境下，面临ROS可能造成的损伤，细胞会发生相应的抗氧化反应，这些抗氧化因素的显著改变也可以作为 OS发生的标志〔13，14〕。

3.1 脂质过氧化物 生物膜脂质的磷脂中含有大量多不饱和脂肪酸(PUFA)，在ROS的作用下，引发脂质过氧化物反应，同时在脂质反应中产生的LOO·也会引发链式反应〔15〕，从而产生各种代谢产物，在AD病人脑内，特别是NFTS中发现大量的OS产物丙二醛(MDA)等〔16〕。丙二醛是脂质过氧化物的裂解产物，其毒性较大，与衰老密切相关。MDA的生成量与脂质过氧化程度相关，故可作为一个检测脂质过氧化的指标。AD患者脑内的脂质过氧化物如，4-羟基壬烯酸(4-HNE)，丙醛等。尽管脂质过氧化物可以通过检测MDA含量定量测定，实验中一般使用TBARS法，但是由于该方法不具有特异性，所以得到的结果并不准确。相比之下，4-HNE比MDA更能反映AD患者的氧化应激状态，可以通过HPLC或者GC/MS测定〔17〕。

但是对于脂质过氧化物的检测，多数通过解剖取得相关脑组织再进行试验，因此如果能找到活体检测方法表征氧化应激的状态就更理想了。磷脂分子中的PUFA氧化形成的过氧化物可以被水解成 F2-和 D2/E2-isoprostanes(IP)。Morrow等〔18〕人的研究发现AD病人脑脊液和脑室液中F2-IsoP水平显著高于正常人。大量实验证明测量IP的含量对于活体无创检测脂质过氧化水平有很好的应用前景。

3.2 蛋白氧化产物 细胞内外富含大量蛋白质，极易受到活性氧的攻击使蛋白质发生变化。ROS能够氧化氨基酸残基侧链生成酮类或醛类衍生物。一些氨基酸诸如组氨酸，精氨酸，赖氨酸等很容易被氧化产生蛋白羰基衍生物〔19〕。Moreira等〔20〕研究发现，羰基是蛋白氧化产物，AD患者脑内也出现蛋白羰基水平增高。蛋白羰基衍生物具有较高的稳定性，且在氧化应激过程中形成很早，故可以通过测定羰基的含量作为判断蛋白质氧化程度的指标。大多数检测蛋白羰基衍生物的方法都是基于羰基链与DNPH反应，再通过特定的DNP抗体进行检测〔21〕。

EPR电磁自旋共振法(也可以称作ESR)也可以用于蛋白氧化的检测。其原理是 2，2，6，6-tetramethyl-4-maleimido-piperidine-1-oxyl(MAL-6)〔22〕能够与半胱氨酸的-SH基团共价结合形成特异性的EPR光谱，用以评价结构信息。EPR光谱能够反映至少MAL-6与膜蛋白结合的两个位点，分为较强S和较弱W。构象的改变或蛋白间作用力的增强会导致W/S比例变小。·OH通过Fenton反应与膜蛋白作用也会导致W/S比例的下降，表明蛋白之间作用力增强〔23〕，从而表征蛋白氧化程度。赵保路〔24〕利用ESR方法，发现了转基因小鼠海马和皮层中活性氧含量升高。

3.3 DNA氧化产物 自由基能够引起自由基损伤，其中最主要是·OH，它能够攻击脱氧核糖，使磷酸二酯键断裂，造成DNA单链或者双链断裂，可以通过碱性洗脱法测定。此外，自由基还会导致DNA蛋白交联，亦或是产生碱基修饰物，例如脱氧鸟苷被氧化产生碱基修饰物8-脱氧鸟苷(8-OHdG)。8-OHdG是DNA氧化损伤的主要产物，已经被公认为最能够反应机体DNA氧化损伤的理想生物指标，在氧化应激领域内被广泛采用。8-OHdG的形成可诱导损伤位点及邻近碱基非特异性配对和错读，其中以 GC-TA置换为主〔25〕，其含量可以通过HPLC或者GC/MS方法测定。

毕胜等〔26〕人的研究中用HPLC测量8-OHdG含量，发现AD病人的淋巴细胞内8-OHdG基础含量显著高于对照组。朱红敏等〔27〕用酶联免疫吸附试验的方法测定AD患者和正常人血浆中8-OHdG的水平，发现AD病人血浆中8-OHdG水平较正常组增高。

3.4 抗氧化物质 机体防御体系的抗氧化能力的强弱与健康程度具有密切联系，该防御体系有酶促与非酶促两个体系，许多酶是以微量元素为活性中心，例如:超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)等，非酶促反应体系中主要为维生素、氨基酸和金属蛋白质。例如:VE、胡萝卜素、VC、半胱氨酸、色氨酸、铜兰蛋白、乳铁蛋白等。Grundman〔28〕的实验发现大量维生素E能够延缓脑功能障碍的产生。这个体系的防护氧化作用主要通过三条途径:①消除自由基和活性氧以免引发脂质过氧化;②分解过氧化物，阻断过氧化链;③出去起催化作用的金属离子。防御体系各成分之间相互起到了协同作用，以及代偿作用与依赖作用。

单独测定某一种或者某些抗氧化成分的含量往往不能全面反映组织的抗氧化能力，且有时在操作上难度较高，也较为繁琐，因此可以测量组织中总抗氧化能力来评价机体总体上的抗氧化活性，这比测量已知的每一种抗氧化剂或者某个自由基含量更为有效和有说服力〔15〕。

4 结语

随着世界人口老龄化，AD在老年人的疾病谱中已占据十分突出的位置，并成为严重威胁老年人健康的四大疾病之一。我国人口老化速度居世界各国之首，AD发病率呈现上升势头，流行病学调查显示，我国每年有近百万新发病例，AD已成为困扰老年人生活质量、给家庭和社会带来沉重经济负担的常见疾病。许多证据表明OS与AD具有密切关系，但现在尚不完全清除究竟OS是AD的发病原因还是产生疾病之后的结果，OS是否是AD中最关键的原因仍有待进一步的实验证明。由于自由基很不稳定，因此寻找敏感、具有特异性、操作简便的方法以及建立完善的评价体系对检测生物体内的自由基水平非常迫切。对于患有AD的患者来说，不断尝试通过减少OS进行治疗应该是可行的〔29〕。相信对AD的深入研究有助于人们更清楚了解该机病的发病机制，从而找出更有效的治疗方法。

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