李秀萍,郑 平,吴幼茹,邹 毅,李 楠*
(1.广西大学 生命科学与技术学院,广西 南宁 530004;2.广西大学 糖业工程技术研究中心,广西 南宁 530004)
广西是我国最大的甘蔗种植地,拥有非常丰富甘蔗资源。甘蔗制糖为传统甘蔗产业,目前为了提高甘蔗产业链,增加甘蔗工业产值,可以利用甘蔗丰富的糖分和富含人体非常有益的维生素、矿物质元素及氨基酸等营养物质,发酵生产具有独特、浓郁甘蔗清香的果酒[1]。甘蔗果酒的酿造关键在于发酵菌株的筛选,而甘蔗生产酒精所选用的酵母发酵性能直接影响到果酒的风味。本实验利用甘蔗蔗汁分别以现有的4株酿酒酵母进行酒精发酵试验,筛选出1株适宜甘蔗酒酿造的酿酒酵母,同时对优选酵母耐性及发酵温度、pH进行相关分析,以便有效地将该酵母应用于实际生产,推动甘蔗果酒产业的发展。
甘蔗汁:广西农业科学院实验基地提供甘蔗自行压榨蔗汁及广西南宁糖业股份明阳糖厂提供。
菌株:4株酵母菌(广西大学生命科学与技术学院朗姆酒研发实验室自选),分别为:1308,1042,31105和32481。
硫酸铵(分析纯)、磷酸二氢钾(分析纯):国药集团化学试剂有限公司;氧化钙(分析纯):南京化学试剂有限公司;浓硫酸(分析纯):成都市科龙化工试剂厂;95%乙醇(分析纯):广东光华科技股份有限公司。
斜面培养基、平板培养基采用马铃薯葡萄糖固体培养基[2];种子培养基采用甘蔗汁液体培养基,将甘蔗汁的初糖浓度调整到13°Bx,添加0.2%(NH4)2SO4及0.6%KH2PO4,用浓硫酸调节pH至4.0;发酵培养基:甘蔗汁液体培养基,根据实验需要调节甘蔗汁的糖度,添加0.2%(NH4)2SO4及0.6%KH2PO4,用浓硫酸调节至适宜pH值。
所有培养基在121 ℃、20 min条件下灭菌,冷却备用。
RE301型旋转蒸发仪:重庆雅玛拓科技有限公司;ZH WY-211B新型大容量全温度恒温培养振荡器:上海智诚分析仪器制造有限公司;Sup-250生化培养箱:上海精宏实验设备有限公司;PAL迷你数显折射计:广州市爱宕科学仪器有限公司;酒精计:余姚仪表二厂有限责任公司。
1.3.1 甘蔗果酒的制备
选取新鲜甘蔗,压榨,纱布过滤,得蔗汁置于80 ℃水浴保温30 min,加入新配制石灰乳调节pH值至7.0,静置取其上清液,根据实验需要浓缩甘蔗汁至适宜糖度,添加0.2%(NH4)2SO4及0.6%KH2PO4,用浓硫酸调节至适宜pH值,以300 mL/500 mL的装液量装入三角瓶中,按体积分数10%的菌种量接种到甘蔗汁发酵液中进行发酸制备甘蔗果酒。
1.3.2 选育酵母产酒精性能的测试
甘蔗汁糖度自然,调节初始pH值为4.0,按体积分数10%的菌种量将酵母种子培养液接种到甘蔗汁液体发酵液中,28 ℃静置发酵7 d,分别测定发酵液中的酒精和残糖含量,根据酒精产量、出酒率、发酵效率、糖利用率确定1株适宜利用甘蔗汁发酵的酿酒酵母。
1.3.3 绘制优选酵母生长曲线及测定不同生长时间甘蔗汁
糖度的变化
按体积分数1%接种量将优选酵母接种至以50 mL/150 mL装液量的种子培养基中,于28 ℃、140 r/min条件下振荡培养36 h,每隔2 h取培养液稀释至合适倍数,并以未接种的甘蔗汁液体培养基作为空白对照,测定其OD560nm值[3],同时对甘蔗汁培养液不同培养时间进行残糖测定。以OD560nm值及残糖含量为纵坐标,培养时间为横坐标,绘制优选酵母生长曲线及不同生长时间甘蔗汁糖度的变化情况。
1.3.4 优选酵母抗性试验测试
(1)耐酒精性能试验
按表1调节培养液乙醇体积分数分别为12%、14%、16%、18%、20%,以10%的接种量将种子液接入不同乙醇含量的培养液中,于28 ℃恒温培养箱培养7 d后,取培养液稀释液涂布平板检测培养液中的酵母数,比较酵母数确定优选酵母的耐酒精性能[4]。
表1 耐酒精度实验培养液配比Table 1 Broth ratio of alcohol tolerance test
(2)耐糖性能试验
将甘蔗汁浓缩,调整初始糖度分别为16°Bx、18 °Bx、20 °Bx、22 °Bx、24 °Bx、26 °Bx、28 °Bx、30 °Bx、32 °Bx、34°Bx、36°Bx、38°Bx,调节pH值至4.5,以300mL/500 mL的装液量装入三角瓶中,按体积分数10%菌种量接入,在28 ℃、140 r/min条件下振荡培养19 h酵母种子培养液,置于28 ℃静置发酵7 d后,测定发酵液中的乙醇和残糖含量,通过最终的酒精度和残糖确定优选酵母的耐糖性能。
1.3.5 优选酵母最适发酵温度和初始pH的确定
(1)最适发酵温度
调整甘蔗汁糖度为26 °Bx,调节初始pH值为4.5,按10%菌种量接入,在28 ℃、140 r/min条件下振荡培养19 h的酵母种子培养液,分别置于22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃静置发酵发酵7 d后,测定发酵液中的酒精和残糖含量。
(2)最适发酵初始pH
调整甘蔗汁糖度为26°Bx,用浓硫酸调节初始pH值分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,按体积分数10%菌种量接入,在28 ℃、140 r/min条件下振荡培养19 h酵母种子培养液,置于28 ℃静置发酵7 d后,测定发酵液中的酒精和残糖含量。
1.3.6 分析方法
总糖含量的测定采用手持式折光仪法;酒精度的测定采用酒精计法[5];酵母数目的测定采用计数法[6]。糖利用率、出酒率、发酵效率计算公式如下[7]:
酿酒酵母品种繁多,性能各异,不同酵母菌株的代谢过程有差异,对可发酵性糖的利用程度不同,而酵母本身的性能是影响果酒品质的重要因素,其选择会导致最终发酵酒精生成率有较大差别,也直接影响了果酒的感官和理化品质[8]。甘蔗果酒生产中,酒精是酵母利用发酵性糖而产生的,因此把利用发酵性糖发酵生成酒精的能力作为衡量优良酵母的一项重要指标[9],各酵母菌株的发酵产酒及发酵液中残糖含量情况分别见图1和图2。
由图1可知,发酵结束后,菌株32481乙醇最高,发酵液中残糖含量最低,最终乙醇含量达到12.6%(V/V);由图2可知,菌株32481发酵出酒率为42.48%,发酵效率为83.13%,糖的利用率42.48%,在4株酿酒酵母中均为最高。以上实验说明菌株32481发酵能力较强、产酒精的能力最好,因此,确定了菌株32481为最佳甘蔗果酒发酵酵母。
图1 不同酿酒酵母产酒精能力及残糖含量Fig.1 Different Saccharomyces cerevisiae alcohol production capacity and residual sugar content
图2 不同酿酒酵母发酵出酒率、发酵率、糖利用率情况Fig.2 Different yeast fermentation alcohol yield,fermentation rate and sugar utilization situation
图3 酵母菌生长曲线及不同生长时间甘蔗汁糖度的变化情况Fig.3 Yeast growth curve and change of sugarcane juice sugar content in different growth period
随着酵母菌的生长,甘蔗汁培养液的营养被消耗,发酵液中的糖逐渐被转化为酒精,导致甘蔗汁的糖度逐渐降低。由图3可以看出,优选酵母的生长曲线符合“S”型生长模型,在接种初期0~8 h,为酵母生长延迟期,在这一阶段,酵母数目及甘蔗汁培养基中的残糖含量变化不大,生长速率几乎为零;8~18 h为酵母生长对数生长期,这一阶段酵母代谢旺盛、大量繁殖,酵母数目迅速增加,培养基中的残糖含量也迅速降低,生长速率达到最大;培养至18 h后酵母细胞生长进入稳定期,由于各种理化条件逐渐不适宜酵母生长,此时活细胞数及培养基中残糖含量保持相对稳定。因此,在进行酒精发酵时选择19 h为酵母种子的接种龄接种至甘蔗汁发酵培养基中进行酒精发酵。
2.3.1 耐酒精性能试验
酒精生产过程中,由于酒精度的提高可以降低蒸馏时的能耗,发酵时应尽可能地提高成熟醪的酒精度,而酒精含量对酵母菌的生长影响很大[10],过高的乙醇含量对酵母本身具有毒性,破坏细胞膜结构和功能,能抑制酵母细胞的生长及繁殖能力,从而杀死酵母,因此要求生产中的酵母要具备一定的耐受酒精的能力[11-12]。
表2 优选酵母对酒精的耐受能力Table 2 Alcohol tolerance ability of preferred yeast
从酵母细胞数可以确定菌株的耐乙醇特性。由表2可以看出,随着起始乙醇体积分数的增大,各菌株培养液的酵母细胞数呈下降的趋势。起始的乙醇含量为12%vol~14%vol时,对各菌株生长影响不大,酵母均可正常生长繁殖;乙醇含量在16%vol~18%vol范围内,酵母菌的生长量明显减少,培养液的酵母细胞数下降均>50%;乙醇含量>18%vol后,酵母基本停止生长,表明20%vol乙醇含量对各菌株生长有较明显的抑制作用。因此,可以确定优选酵母能够耐受乙醇含量最高为18%vol。
2.3.2 耐糖性能试验
总糖含量是影响酒精发酵的重要因素,但随着总糖含量的增加,酵母的生长和发酵会受到一定的抑制,当总糖含量>270 g/L时,高浓度的糖导致渗透压增加,抑制细胞活性,酵母生长及酒精发酵缓慢而且糖利用率较低,从而影响最终发酵效果[13]。
由图4可知,高浓度的总糖可产生高浓度的酒精,随着初始糖度的不断升高,优选酵母的生长和发酵逐渐受到一定的抑制,发酵液中的残糖含量也随之升高,发酵液中糖利用率、出酒率、发酵效率不断降低。在初始糖浓度为16~26°Bx时,优选酵母可以正常生长,酒精发酵没有影响,并且随着初始糖度的增加,酒精发酵逐渐增强,在初始糖度为26°Bx时,发酵液中酒精含量最高;初始糖度>36°Bx时优选酵母活力迅速降低,酒精发酵能力受到抑制。因此根据表7可以确定该优选酵母最高耐受糖浓度为36°Bx,说明该菌株能耐受较高的渗透压,有利于今后在高浓度酒精发酵工艺中应用。
图4 优选酵母对糖度的耐受能力Fig.4 Sugar tolerance ability of preferred yeast
2.4.1 优选酵母最适发酵温度的确定
温度是影响酵母生长繁殖和发酵作用的一个重要因素[14]。由图5可知,温度过低或过高均不利于优选酵母进行酒精发酵,其中,当发酵温度为28 ℃时,酒精度达到最高,糖利用率、出酒率、发酵效率最高,故确定优选的最适发酵温度为28 ℃。
图5 发酵温度对甘蔗汁酒精度的影响Fig.5 Effect of fermentation temperature on sugar cane juice alcohol content
2.4.2 优选酵母最适发酵初始pH值的确定
图6 初始pH值对甘蔗汁酒精度的影响Fig.6 Effect of initial pH on sugar cane juice alcohol content
pH对酵母代谢有很大的影响,能够影响细胞吸收营养物质的能力及其生物酶活性[15]。由图6可知,过高或过低的pH会抑制酵母细胞酶的活性及阻碍新陈代谢,使得酵母继续生长受阻,从而影响最终发酵能力,其中,当初始pH值为4.5时,酒精产量达到最高,糖利用率、出酒率、发酵效率最高,故确定优选酵母的最适发酵初始pH值为4.5,此时甘蔗果酒的酒精度为13.4%vol,糖利用率为60.38%,出酒率为40.66%,发酵效率为79.58%。
对供试4株酵母发酵特性的对比研究结果表明,各酵母在甘蔗汁中产酒精能力大小排序为32481>31105>1043>1308,确定了菌株32481为最佳甘蔗果酒发酵酵母;在酒精发酵过程中,温度、pH值、酒精含量、底物浓度对酵母发酵性能影响较大。实验结果表明,优选酵母最高能够耐受乙醇含量18 %vol、耐受糖浓度为36 °Bx,最佳发酵初始糖度为26°Bx;最适的发酵温度为28 ℃、初始pH值为4.5。在此发酵条件下,甘蔗果酒的酒精度达到13.4%vol,糖利用率为60.38%,出酒率为40.66%,发酵效率为79.58%。优选酵母具有产酒率高、耐酒精及耐高糖性能等特点,发酵所得原酒色泽金黄透亮,果香、酒香浓郁、协调。但是,为了使该菌株能够推广应用,仍需对菌株的其他特性和发酵工艺进行深入研究。
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