酿酒酵母发酵条件的研究

赵小丽，甄玉国 *，王兰惠，陈 雪

（1.吉林农业大学 吉农博瑞奶牛饲料研发中心，吉林 长春 130118；2.长春博瑞饲料集团有限公司技术中心，吉林 长春 130114）

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为人类利用最早的微生物，其营养成分十分丰富，含有菌体蛋白质、多种氨基酸、维生素、脂肪、食物纤维、矿物元素及生理活性物质等[1]。由于其具有安全、生长繁殖快、代谢周期短、生产不受季节和气候、土壤、自然灾害的影响，与传统的农业生产方式相比，过程易于控制，容易进行大规模培养、菌体蛋白质丰富等优点，一直是基础和应用研究的主要对象，并被广泛应用于酿造、食品、医药、饲料工业等领域[2-4]。实验室酵母培养条件包括培养时间、初始pH、接种量、温度、转速、装液量等[5-8]。温度是影响酵母生长的重要因子，大多数酵母菌在28～30 ℃时生物量最大。酵母生长与溶氧速率密切相关，因此调节转速与装液量是调控酵母生长的有效手段。不同的酵母菌株其生物学特性也不完全相同[9]，因此本试验针对试验用菌株利用实验室优化的培养基，通过单因素和正交试验设计，筛选酿酒酵母培养条件的优化组合，为工业化生产酵母蛋白提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料

供试菌株由实验室前期试验获得，经分子生物学鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

甜菜糖蜜：黑龙江拜泉糖厂；尿素、甘氨酸、硫酸镁：北京化工厂；红糖（食品级）：市售。葡萄糖、琼脂、酵母浸粉（N＞9%）、蛋白胨（N＞14.5%）：北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.1.2 培养基

酵母斜面培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，琼脂15 g/L，115 ℃、0.1 MPa条件下灭菌20 min。

酵母液体种子培养基—酵母浸出粉蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，115 ℃、0.1 MPa条件下灭菌20 min。

摇瓶发酵培养基为试验前期筛选优化的培养基：糖蜜总糖含量为10%、红糖10%、尿素0.5%、酵母粉0.5%、硫酸镁0.05%、甘氨酸0.05%，115 ℃、0.1 MPa条件下灭菌20 min。由于尿素在高温高压条件下分解，因此将尿素配成一定浓度的水溶液，经0.22 μm滤膜过滤除菌后加入灭菌的培养基中。

1.2 仪器与设备

pHS-2C型数字式酸度计：上海SANXIN公司；AL104电子天平：梅特勒-托利多公司；岛津UV-1201分光光度计：日本岛津公司；Eppendorf 5810R高速冷冻离心机：德国艾本德股份公司；YP1200型电子天平：上海精科实业有限公司；HYG-型培养摇床：上海欣蕊自动化设备有限公司；SPX-150 型生化培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；SW-CJ-IF型洁净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株活化

无菌条件下接1环保藏菌种至YPD斜面培养基，30 ℃培养48 h复苏菌种。

1.3.2 种子扩大培养

取1环活化后的斜面菌种转接到装液量为20 mL/100 mL的种子培养基中30 ℃、180 r/min 条件下培养24 h，发酵液经20倍稀释后OD560nm达到0.72。

1.3.3 菌体干质量测定

发酵液在5 000 r/min条件下离心10 min，蒸馏水洗涤2次后收集菌体，105℃烘干至质量恒定，称质量并记录数据。

1.3.4 培养基优化单因素试验

培养基初始pH5.0、培养基装液量20 mL/100 mL，30 ℃、4%接种量、150 r/min摇床培养24 h，菌体干质量为16.63 g/L。分别改变培养时间、接种量、初始pH、培养温度、转速5个因素，菌液经适当稀释后，以同样稀释倍数的培养基为空白对照，用紫外可见分光光度计在波长560 nm处测定光密度值，即OD值。以菌液光密度值为考查指标，研究各因素对菌株生物量的影响。

1.3.5 培养基配方优化正交试验

根据单因素试验结果，选取对菌体生物量影响较大的因素设计正交试验，以波长560 nm处的OD值为考查指标，研究发酵条件的最佳组合。

1.3.6 数据处理

试验数据采用SPSS17.0软件，Duncan’s 检验进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 培养时间的选择

在培养基初始pH5.0，培养基装液量20 mL/100 mL，温度30 ℃，4%接种量，转速150 r/min摇床培养的条件下培养菌体，分别在24 h、36 h、48 h、60 h、72 h取样，发酵液经适当稀释后测定OD560nm。培养时间对菌体OD560nm的影响见图1。

由图1可知，随着培养时间的延长，菌体密度呈现逐渐增大的趋势，经单因素方差分析，培养48 h与60 h的菌密度差异不显著（P＞0.05）；因此从时间效率考虑培养时间为48 h。

图1 培养时间对菌体OD560nm的影响Fig.1 Effect of culture time on cell OD560nm

2.1.2 培养温度的选择

在培养基初始pH5.0，培养基装液量20 mL/100 mL，时间48 h，6%接种量，转速150 r/min摇床培养的条件下培养菌体，将培养温度设置为26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃分别进行培养，培养结束后发酵液经适当稀释后测定OD560nm。培养温度对菌体OD560nm的影响见图2。

图2 培养温度对菌体OD560nm的影响Fig.2 Effect of culture temperature on OD560nm

在发酵过程中，温度的变化将导致微生物生长和繁殖速度的改变以及微生物酶活性的变化，进而影响产品质量和产量。外部环境温度的升高和微生物自身代谢放出的热量，会导致发酵温度升高，影响菌体的繁殖代谢[10]。由图2可知，低温培养较高温培养时菌密度偏高，可能是因为培养温度偏低，使得菌体细胞内酶的催化活性较低，延缓了菌体组成物质的合成速度，抑制细胞生长的代谢产物的积累速度放缓，从而有利于细胞的增殖；培养温度偏高，培养初期细胞生长繁殖很快，但由于供氧速度的限制和不利于生长的代谢产物的积累，影响了最终的细胞数量。经单因素方差分析28 ℃条件下菌密度显著高于30 ℃和26 ℃条件下的菌密度（P＜0.05），因此选择28 ℃作为适宜的培养温度。

2.1.3 接种量的选择

在培养基初始pH 5.0，培养基装液量20 mL/100 mL，温度28 ℃，培养时间48 h，转速150 r/min摇床培养的条件下培养菌体，将接种量分别设定为2%、4%、6%、8%，培养结束后发酵液经适当稀释后测定OD560nm。不同接种量对菌体OD560nm的影响见图3。

图3 接种量对菌体OD560nm的影响Fig.3 Effect on inoculums on cell OD560nm

由图3可知，菌密度在接种量为2%～6%范围内随着接种量的增加而增大，因为培养基所提供的营养水平和溶氧速率只能满足一定数量酵母细胞生长繁殖所需。当接种量超过6%后，一方面造成一部分细胞的营养供给不足，从而限制这一部分菌体的生长繁殖，另一方面由于接种量过大，即使培养基中营养物质的供给能够满足其生长，但由于溶氧速率的延后性，不能满足生长旺盛细胞对氧的需求，从而使细胞从有氧代谢转变为厌氧代谢，伴随厌氧代谢物（如乙醇）的积累抑制了细胞的生产，反而降低了最终的细胞浓度。过高的接种量对增加酵母数没有积极的影响，因此选择6%作为适宜的接种量。

2.1.4 初始pH值的选择

在培养基装液量20 mL/100 mL，温度28 ℃，培养时间48 h，6%接种量，转速150 r/min摇床培养的条件下培养菌体，将初始pH值设定为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0分别进行培养，培养结束后发酵液经适当稀释后测定OD560nm。不同初始pH值对菌体OD560nm的影响见图4。

图4 初始pH对菌体OD560nm的影响Fig.4 Effect of initial pH on OD560nm

由图4可知，初始pH值为6.0时菌体密度最高，经方差分析，初始pH6.0与pH5.0、pH5.5条件下的菌体密度差异不显著（P＞0.05），但显著高于pH4.5条件下（P＜0.05）。原因可能是多数微生物生长适应的pH跨度为3～4个单位，但其最佳生长pH跨度为0.5～1个单位[11]。酵母菌的生长偏向于在酸性环境中，因此选择pH 5.0作为适宜的初始pH。

2.1.5 转速的选择

在培养基初始pH5.0，培养基装液量20 mL/100 mL，温度28 ℃，培养时间48 h，6%接种量的条件下培养菌体，将摇床转速设定为120 r/min、150 r/min、180 r/min、210 r/min分别进行培养，培养结束后发酵液经适当稀释后测定OD560nm。不同转速对菌体OD560nm的影响见图5。

图5 转速对菌体OD560nm的影响Fig.5 Effect of rotate speed on cell OD560nm

由图5可知，菌密度随着振荡速度增加而提高，通常在空气流量一定的情况下，振荡速度的变化直接影响氧在发酵液中的传质效率，溶氧是高密度发酵过程中影响菌体生长的重要因素，溶解氧浓度过高或过低都会影响微生物的代谢[12-13]，进而影响正常的细胞生长和代谢产物的形成[14]。培养液中的溶氧随着振荡速度的增加而增加，有利于菌体生长，但并不是转速越大越好，过高的转速对菌体的剪切力增大，反而不利于菌体的增殖。经单因素方差分析，转速150 r/min与180 r/min条件下的菌体密度差异不显著（P＞0.05），但显著高于120 r/min条件下（P＜0.05），因此选择150 r/min作为适宜的转速。

2.2 酵母发酵条件优化正交试验

根据单因素试验结果，选取培养温度、发酵液pH值、培养时间、接种量4个因素设计正交试验，采用L9（34）的正交设计表，试验因素与水平见表1，试验结果与分析见表2，方差分析见表3。

由表2极差分析结果可知，RC＞RB＞RD＞RA，即温度对菌体生物量的影响最为显著，然后依次为初始pH、接种量、培养时间。发酵条件的最佳组合为A1B3C1D1，即发酵时间36 h、初始pH5.5、温度26 ℃、接种量4%。以此培养条件进行验证试验，3次重复验证试验结果表明该组合确为该株菌的最适培养条件，在此优化条件下培养菌体，其OD560nm为1.370，菌体密度为1.54×108个/mL，干质量可以达到18.48 g/L，比初始条件下菌体干质量提高了约10%。

表1 酵母发酵条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for fermentation condition optimization

表2 酵母发酵条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test for fermentation condition optimization

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test result

对试验数据进行方差分析，由表3方差分析结果可知，在试验设定的范围内培养时间和接种量对菌体生物量的影响差异不显著（P＞0.05），而初始pH和培养温度对菌体生物量有显著影响（P＜0.05）。

3 结论

采用前期筛选的发酵培养基来培养酿酒酵母，通过单因素试验和正交试验设计考查不同培养条件对菌体生物量的影响，得到的最佳发酵条件为发酵时间36 h、初始pH值为5.5、温度26 ℃、接种量4%、转速150 r/min、装液量20mL/100mL，在此优化条件下培养菌体，其OD560nm为1.370，密度为1.54×108个/mL，干质量可以达到18.48 g/L，比初始条件下菌体干质量提高了将近10%。

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