大鼠心包腔内注射辣椒素诱发c-Fos在孤束核内的表达及迷走神经切断对其表达的影响

刘晓华，韩 曼，杜剑青

(1.陕西中医学院生理学教研室，陕西咸阳 712046；2.西安交通大学 医学院生理学与病理生理学系，陕西西安 710061)

以往研究表明心脏感觉信息主要伴随心交感神经和心迷走神经的传入纤维，经不同的通路上传到中枢神经系统引起相应的反应[1]。伴随心交感神经的感觉传入冲动，其神经元胞体位于星状神经节和交感神经链，中枢突进入脊髓胸1～6节段后角和中间带外侧核。由后角换元后发出二级传入纤维，可能经脊髓丘脑束上传至高位中枢，其投射纤维可到达下丘脑和大脑皮质而产生痛觉。束路追踪实验表明这些来自胸脊髓背角的传入纤维有部分投射到位于延髓的孤束核(nucleus tractus solitarius, NTS)[2-3]。伴随迷走神经的感觉纤维中枢突经结状神经节直接投射到NTS、迷走神经背核及网状结构的心抑制区，再由这些结构发出传出冲动而完成反射活动[4-5]。可见NTS既中转伴随心交感传入的感觉神经冲动，也是心迷走神经的感觉纤维中枢投射部位，在心脏伤害性感受的传递中扮演重要的角色。

辣椒素可以选择性地激活感觉神经元的初级传入末梢，被广泛用于揭示痛觉的神经生物学机制的研究领域[6]。研究表明辣椒素受体亚型瞬时型感受器电位的香草醛受体( transient receptor potential vanilloid receptor, TRPV1)广泛分布于心肌和心脏表层的C类纤维末梢，是心脏重要的伤害性感受器[7-8]。QIN等[7]发现激活辣椒素敏感的心脏传入纤维能显著改变脊髓内心脏伤害性感受神经元的活动。c-Fos是原癌基因中的即刻早期基因产物，1987年英国的HUNT等[9]首先将原癌基因用于痛觉研究中。目前，c-Fos被认为是伤害性感受神经元兴奋的标志物。

本实验通过观测心包内注射辣椒素诱发NTS内c-Fos的表达，同时记录以背斜方肌的肌电(electromyogram, EMG)反应为观测指标的心脏-躯体运动反射，探讨NTS内不同亚核及迷走神经在心脏伤害性信息传递中的作用。

1 材料与方法

1.1仪器和药品BL-420生物信号采集与分析系统(成都泰盟生物科技有限公司)；压力换能器(成都泰盟生物科技有限公司)；连续注射泵(KD100，美国KD科学公司)；小动物呼吸机(DW3000-B型，淮北正华生物仪器设备有限公司)；大鼠脑立体定位仪(日本Narishige公司)；冰冻切片机(Kryostat 1720，德国Leitz公司)；Olympus生物显微镜(BX51，日本Olympus公司)；戊巴比妥钠、辣椒素(美国sigma公司)；兔抗大鼠c-Fos多克隆抗体(AB7963，美国Abcam公司)；ABC Kit免疫组化试剂盒(PK-6101，美国Vector公司)。

1.2实验动物及手术采用健康、雄性SD大鼠，体质量260～330 g。动物经戊巴比妥钠(45～55 mg/kg，i.p.)麻醉后，仰卧位于实验台上，气管插管后连接小动物呼吸机进行人工呼吸(呼吸频率60～70 次/min，潮气量5.0～6.0 mL)。颈总动脉插管监测动脉血压，颈静脉插管用于实验过程中静脉注射以维持戊巴比妥钠麻醉[10～15 mg/(kg·h)]。温控仪维持动物体温在(37±0.5)℃。

心包插管术：1～3肋骨处开胸暴露胸腺，沿中线钝性分离左右胸腺组织暴露心脏后，用玻璃探针在心包膜上开一小孔，将一长12～14 cm、内径0.020、外径0.037、远端有3～5个小孔的硅胶管插入心包约2 cm，逐层缝合各层胸壁组织。

1.3分组及处理随机分为6组：空白对照组、假手术组、溶媒注射组(溶媒组)、辣椒素注射组和迷走神经切断组、迷走神经切断后心包内注射辣椒素组。每组n=5。

空白对照组大鼠未进行任何手术处理。假手术组大鼠进行所有手术但不注射任何药物，6 h后灌注取材。溶媒组手术后4 h，回抽心包积液后心包腔内注射辣椒素溶媒即含有相应百分比的吐温80和无水乙醇的生理盐水0.2 mL，2 h后灌注取材。辣椒素组除心包内注射物为辣椒素(0.01 g/L)外，其余同溶媒注射组。迷走神经切断组手术后切断双侧颈迷走神经，6 h后灌注取材。迷走神经切断后心包内注射辣椒素组在双侧颈部迷走神经切断后，大鼠恢复4 h，心包内注射辣椒素，2 h后灌注取材。

辣椒素溶液制备方法为：辣椒素(干粉)1 mg溶于含有0.5 mL吐温80和0.5 mL无水乙醇混合液中，4 ℃保存。使用时用生理盐水稀释到0.01 g/L。

1.4背斜方肌肌电记录每次心包注射的同时记录以左侧背斜方肌EMG活动为指标的心脏-躯体运动反射，作为心脏伤害性刺激的间接指标。实验动物取俯卧位，左侧肩胛处暴露背斜方肌。同芯电极以30°角度，1.5～1.7 mm深，插入斜方肌记录其EMG信号。

1.5ABC免疫组织化学法观察各组大鼠NTS内c-Fos的表达根据以往研究，急性诱发的c-Fos表达在伤害性刺激后1～2 h到达高峰，3～4 h下降。由于本实验手术创伤较大，为了避免手术本身对心包腔内辣椒素诱发的NTS内c-Fos表达的影响，心包内注射均在手术完毕后4 h进行，c-Fos的表达在心包腔内伤害性刺激后2 h观察。

各组大鼠处理后，暴露心脏，经左心室-主动脉插管灌注固定。先用200 mL 0.01 mol/L PBS(pH 7.4)快速灌流，继之以含300 mL/L饱和苦味酸和40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L PB(pH 7.4)固定溶液约500 mL灌流固定。取脑后固定于40 g/L多聚甲醛固定液中6 h后，转入含300 g/L蔗糖的0.1 mol/L PB溶液中(4 ℃)沉底后，冰冻切片，片厚20 μm。按照切片顺序每隔3张取2张脑片，分为2组收集于含0.01 mol/L的PBS的洗片盒中备用，每组10～15张脑组织片，分别进行免疫组化和阴性对照。免疫组织化学ABC法染色时兔抗鼠c-Fos抗体工作浓度为1∶1 000，阴性对照实验用PBS代替一抗，其余步骤相同。用Olympus光学显微镜(BX51)照相，用软件SPOT对脑片切片进行图像采集，用Imag-Pro-Plus软件计数。

2 结 果

2.1各组大鼠心包刺激诱发的背斜方肌EMG活动的变化辣椒素溶媒组大鼠背斜方肌均无EMG活动，辣椒素注射组大鼠均有EMG反应，数量为(1 984±126)个，迷走神经切断组心包内注射辣椒素EMG反应为(1 170±114)个，两组比较差异有统计学意义(P<0.05，图1)。

图1心包内注射诱发的背斜方肌肌电图实例

Fig.1 Examples of intra-pericardium injection induced EMG activities

2.2心包腔内注射辣椒素后NTS内c-Fos的表达免疫组织化学结果显示，假手术组和溶媒注射组c-Fos表达阳性细胞数与空白对照组相比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；心包腔内注射辣椒素后，NTS内c-Fos表达阳性细胞数明显增多，与空白对照、假手术组和溶媒组比较差异均有统计学意义(P<0.05，图2、表1)。辣椒素诱发c-Fos的表达主要集中在NTS内的联合亚核，背内侧亚核以及腹外侧亚核。

图2心包腔内注射辣椒素增加NTS内(前囟后-14.3mm)c-Fos的表达

Fig.2 c-Fos increase in NTS at bregma -14.3 mm after intrapericardiac injection of capsaicin

A：空白对照组； B：假手术组；C：溶媒组；D：辣椒素组；标尺=100 μm。AP：最后区；SolC：孤束核联合核；SolDM：孤束核背内侧亚核；SolVL：孤束核腹外侧亚核；DmV：迷走神经背核；cc：中央管。

表1各组大鼠NTS内c-Fos免疫阳性细胞数目的比较

Tab.1 Comparison of c-Fos-positive cells count in NTS in each group

组 别NTS内c-Fos阳性细胞数空白对照组 9±4假手术组11±5溶媒注射组12±5辣椒素注射组198±14*迷走神经切断组10±7迷走神经切断+辣椒素注射组101±12*#

2.3迷走神经切断对心包腔内辣椒素诱发的NTS内c-Fos表达的影响颈部双侧迷走神经切断组的NTS内c-Fos阳性细胞数与空白组、假手术组、溶媒组比较差异均无统计学意义(P>0.05，表1)；而迷走神经切断后心包内注射辣椒素组的NTS内c-Fos阳性细胞数较辣椒素组明显下降(P<0.05，表1、图3)，与其余各组比较差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

3 讨 论

目前，对心绞痛的发生机制以化学假说为主，认为心脏痛觉的发生通常由心肌缺血释放的多种化学物质(BK、5-HT、腺苷等)兴奋心肌的感觉神经末梢引起[10-11]。心包内给予或冠状动脉内直接注射致痛化学物质均可以引起分布于心脏和冠状动脉的传入纤维的强烈反应。JOU等[12]利用大鼠急性心包插管模型证明心包腔内注射化学刺激物和冠状动脉结扎同样能激活心脏伤害性感受相应的中枢感受区。急性或慢性心包腔内置管后，心包内注射化学致痛剂的心脏痛觉模型已被广泛应用于心脏感觉的研究领域[13-14]。但是，利用辣椒素作为化学刺激，观察心包腔内注射辣椒素在NTS诱发的c-Fos的研究比较少。本研究中心包内注射辣椒素后，诱发心脏-躯体运动反射和NTS内c-Fos免疫阳性神经元表达明显上升，提示辣椒素可以作为一种化学刺激物激活心脏伤害性感受神经末梢，同时说明NTS是心脏伤害性感受的中继核团。c-Fos免疫阳性神经元在NTS内主要表达在联合亚核、背内侧亚核以及腹外侧亚核，说明NTS内的联合核和内侧亚核是参与心脏伤害性感受信息传递的主要亚核，这一结果和以往束路追踪研究的结果一致。COBETT等[15]利用逆行追踪的方法证明，大鼠心包内注射霍乱毒素B后，在NTS内的联合亚核、背内侧亚核以及腹外侧亚核均可见逆行的霍乱毒素B与谷氨酸囊泡转运体有共表达。神经生理学的研究进一步证明化学损毁该部位对心脏伤害性信息有明显抑制作用，而微量注射谷氨酸于该部位对心脏伤害性感受有明显易化作用[16]，提示该部位与心脏伤害性信息的中枢传递密切相关。同时，众多研究提示NTS的联合亚核、背内侧亚核以及腹外侧亚核也参与心血管反射等多种内脏反射活动的调节[17]。

图3迷走神经切断减少心包腔内注射辣椒素诱发的NTS内c-Fos的表达

Fig.3 Bilateral vagus transaction reduced intrapericardiac capcaicin evoked c-Fos expression in NTS

A：心包内注射辣椒素；B：迷走神经切断后心包内注射辣椒素。标尺=100 μm。

电生理研究表明，心脏表面给予BK或者混合致痛剂在迷走神经和交感神经纤维上均能记录到动作电位，提示迷走神经和交感神经在心脏伤害性感受的传入中均有重要作用[18]。为明确迷走神经在辣椒素诱发的心脏伤害性感受传递中的作用，本实验观察了双侧颈部迷走神经切断对辣椒素诱发的NTS内c-Fos表达的影响，结果发现迷走神经切断明显降低了心包腔内注射辣椒素诱发的NTS内c-Fos阳性神经元的数量，同时心包内辣椒素诱发的脊髓背斜方肌EMG活动比迷走神经完整时减少。此两项结果提示伴随迷走神经传入的感觉传入纤维在心脏伤害性感受的传递中扮演重要角色。但是，本实验心包腔内注射辣椒素诱发的NTS内c-Fos阳性细胞的水平在迷走神经切断后和对照组比较仍有显著差异，提示NTS除了接受伴随迷走神经传入的感觉纤维投射外，同时也是心脏伤害性信息其他传入通路的中继站。束路追踪研究表明心脏交感神经的传入纤维在上胸段脊髓背角换元后可上行投射至NTS[3]，提示迷走神经切断后NTS内c-Fos的表达可能与心交感出入的伤害性信息有关。对于交感神经在心脏伤害性感受中的作用还需进一步的研究。

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