正交法优化新疆芦苇根蘑菇液体培养基的研究*

郭永红,张微思，何 容，罗晓莉，黄仕文，桂明英**

(1.云南省食用菌工程技术研究中心，云南 昆明 650223；2.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223；3.文山州砚山县八嘎乡农技站，云南 砚山 663100)

〈栽培技术〉

正交法优化新疆芦苇根蘑菇液体培养基的研究*

郭永红1,2,张微思1,2，何 容2，罗晓莉2，黄仕文3，桂明英2**

(1.云南省食用菌工程技术研究中心，云南 昆明 650223；2.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223；3.文山州砚山县八嘎乡农技站，云南 砚山 663100)

本文采用液体培养法，研究新疆芦苇根蘑菇对碳氮源的利用情况，并以四因素三水平的正交试验进行培养基配方的优化。结果表明，新疆芦苇根蘑菇的最适培养基配方为糊精30 g·L-1、酵母粉2 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、KH2PO40.25 g·L-1。

新疆芦苇根蘑菇；液体培养基；正交试验

新疆芦苇根蘑菇，采自新疆郭音巴楞州博湖县芦苇荡，该蘑菇具有营养丰富、味道鲜美、子实体大等特点，市场销量逐年增加。为满足人们的生活需要，开发新疆芦苇根蘑菇种质资源已成为人们研究的新课题。通过实地采样后对其子实体进行了组织分离，成功获得斜面母种，并对其进行了液体培养基的优化。即从液体培养常用的几种碳氮源中筛选出较优者[1]，并采用正交试验的方法获得碳源、氮源、无机盐3种营养成分之间的最合理搭配[2，3]，获得蘑菇的最适液体培养基，为人工栽培提供可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

新疆芦苇根蘑菇，分离自新疆郭音巴楞州博湖县芦苇荡蘑菇。

1.1.2 培养基

PDA培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%，pH自然；基础培养基：葡萄糖2%、蛋白胨0.2%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.05%、VB10.01%，pH自然。各碳源、氮源不同的培养基分别取代其中的葡萄糖和蛋白胨，其余成分不变。配方见表1。

表1 液体培养基配方

1.2.1 斜面菌种制备

将新疆芦苇蘑菇进行组织分离，接种于斜面培养基上，于25℃培养7 d。

1.2.2 培养方法及条件

取2小块1 cm2菌块接种于液体培养基，使菌丝朝上悬浮于液体培养基，置于25℃培养箱静止培养，每天观察并记录菌丝生长情况。

1.2.3 菌丝体生物量的计算

过滤发酵液，清洗菌丝体出去残留培养基，60℃烘箱烘干菌丝体至恒重，称重并计算生物量(M，g·L-1)，公式为：

M=m1100×1000

式中：m1为100 mL发酵液中菌丝体干重。

综上所述，国内尿素走势并不如意，开工率下滑利好不断被业内炒作，或已透支；所谓的印度招标利好也不及预期。不可否认，当前行业低开工局面确实给低库存或零库存的尿素企业提供了挺价筹码，但内需疲软，暂时不允许工厂去考虑“货紧价扬”。换而言之，或许淡储期间的供应量不及往年水平，下游经销商库存量偏低，但并不能改变此时下游对高价尿素的不认可。当然，不排除众多经销商在本轮尿素跌价期间等待新的抄底机会，但相应心理价位仍需进一步博弈。预计11月底，国内尿素主产区报价2000元/吨左右。

1.2.4 最适碳氮源筛选试验

(1)最适碳源试验

分别以2%葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、麦芽糖、果糖、糊精作为基础培养基的碳源，按配方配制7组培养基，每组3个重复。

(2)最适氮源试验

分别以0.2%蛋白胨、尿素、牛肉膏、酵母粉、NH4Cl、NH4NO3、NaNO3作基础培养基中的氮源，按配方配7组培养基，每组3个重复。

将配好的培养基装入500 mL的三角瓶中，每瓶装100 mL，121℃灭菌20 min。冷却后接种，于25℃培养箱振荡培养，每天观察并记录菌丝生长情况，至菌丝最旺时称量菌丝体干重。

1.2.5 正交试验

考虑碳氮比及无机盐之间的交互作用对菌丝体生长的影响，选取最适碳氮源试验中得到的碳源和氮源，无机盐采用KH2PO4、MgSO4·7H2O，维生素选择VB1，设计四因素三水平的正交试验。用L9(34)正交试验方法以发酵终点菌丝体干重为主要指标，筛选4者之间的最优搭配，每组设3次重复。

2 结果与分析

2.1 最适碳源筛选结果

发酵终点称量各供试培养基中菌丝体干重，计算出生物量，结果见图1。

由图1可知，蘑菇菌丝生长能优先利用的碳源为糊精，生物量为2.93 g·L-1；其次为乳糖、蔗糖、果糖；而该蘑菇对淀粉的利用率最差。最后，选择糊精作为蘑菇生长的最佳碳源来进行氮源的筛选试验。

2.2 最适氮源筛选结果

发酵终点称量各供试培养基中菌丝体干重，计算出生物量，结果见图2。

由图2可知，菌丝生长的最适氮源为酵母粉，生物量高达3.61 g·L-1；其次为牛肉膏和尿素，生物量分别为 2.64 g·L-1、2.61 g·L-1；利用较差的为无机氮源，其中以NaNO3最差。表明该蘑菇在以有机氮源进行液体发酵时，菌丝体生物量产率明显高于无机氮源，可见在其菌丝体生长过程中，对有机氮源的利用优于无机氮源，而对这几种无机氮源的利用相差不大。最后选择酵母粉作为蘑菇液体培养基的最佳氮源进行正交试验。

2.3 正交试验优化蘑菇发酵培养基

以得到的最适碳源糊精作为碳源，最适氮源酵母粉作为氮源，以及无机盐KH2PO4、MgSO4·7H2O作为正交试验四因素，设计了四因素三水平的正交试验，其设计及结果见表2和表3。

表2 L9(34)正交试验因素水平表

表3 正交实验结果L9(34)

根据极差大小，判断因素的主次影响顺序，R越大，表示该因素的水平变化对试验指标的影响越大，因素越重要。由表3可知，糊精对蘑菇菌丝的生长影响最大，其次是无机盐MgSO4·7H2O和酵母粉，KH2PO4对菌丝生长的影响最小。各因素的主次顺序为A>D>B>C，A因素为主要因素，C因素为不重要因素。

进一步考察各因子对指标的影响，对正交试验进行了方差分析，见表4。

表4 正交实验的方差分析

注：F0.10(2，8)=3.11。

从表4的方差分析结果可以看出，因素A在90%的置信度下的F比大于F0.10(2，8)，表明糊精对试验结果有一定的影响；因素B、C、D对试验影响不显著。从极差分析和方差分析结果可以确定培养基的最佳组合为A3B3C2D1，即糊精30 g·L-1、酵母粉3 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.0 g·L-1、KH2PO40.25 g·L-1。

3 结论

碳源试验结果显示，乳糖、蔗糖、果糖、糊精有利于蘑菇菌丝生长，其中以糊精最好。

氮源试验表明，酵母粉、牛肉膏和尿素是蘑菇较适宜的发酵氮源，二无机氮源不利于菌丝体的生长。

L9(34)正交试验结果确定的蘑菇液体发酵的最佳培养基组分为糊精30 g·L-1、酵母粉3 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.0 g·L-1、KH2PO40.25 g·L-1。

[1]刘东，李世敏，许柏球，等. 灵芝菌丝体深层液体培养基研究[J]. 微生物学杂志，2001，21(2)：15-17.

[2] 杨立红，倪新江，黄清荣，等. 栽培基质对巴西蘑菇胞外酶活性的影响[J]. 吉林农业大学学报，2004，26(6)：284-286.

[3] 王怡平，肖亚中，沈中兴，等. 正交试验法优化食用菌深层发酵的泥炭培养基[J]. 安徽大学学报，1996，20(2)：93-97.

Orthogonal Optimization of Liquid Medium of Xinjiang Reed Root Mushroom

GUO Yong-hong1,2, ZHANG Wei-si1,2, HE Rong2, LUO Xiao-li2, HUANG Shi-wen3, GUI Ming-ying2

(1.Edible Fungi Engineering Technology Research Center of Yunnan Province, KunmingYunnan650223; 2.Kunming Edible Fungi Institute of China Co-op, KunmingYunnan650223; 3.Agricultural Technician Station of Baga Counthy of Wenshan State, YanshanYunnan663100)

By liquid culture, Xinjiang reed root mushroom on the utilization situation of carbon and nitrogen source were studied, using orthogonal experiment with four factors and three levels for optimizating the formula of medium. The results showed that the optimal culture medium formula of Xinjiang reed root mushroom was dextrin 30 g·L-1, yeast extract 2 g·L-1, MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1, KH2PO40.25 g·L-1.

Agaricus; Liquid Medium; Orthogonal test

*项目来源：国家科技支撑计划课题“野生食用菌资源保护与开发利用技术研究”(2013BAD16B01)。

郭永红(1964-)，女，研究员，主要从事食用菌资源保护及食用菌栽培技术研究。E-mail:guoyonghong@126.com

**通信作者：桂明英，研究员，主要从事食用菌资源的保护开发与研究。E-mail：guimingying@126.com

2013-11-24

S646.9

A

1003-8310(2014)01-0017-03