加味当归补血汤对肿瘤化疗所致小鼠免疫功能低下的影响

黄朝忠，刘 智，苏 颖，胡亚男

(长春中医药大学，长春 130117)

目前绝大多数肿瘤患者依然采用术后放化疗治疗，但是放化疗在取得临床疗效的同时其毒副作用越来越严重的影响术后的整体治疗与康复，尤其是对机体的免疫功能产生严重的破坏，因此，在临床当中采取有效的预防治疗措施降低其毒副作用显得尤为重要，引起人们的广泛关注[1]。随着中医药在临床治疗肿瘤过程中的尝试与运用，尤其是在提高放化疗患者免疫力方面，已经受到医学领域的重视[2]。本研究从临床实际出发，采用气血相生的加味当归补血汤，通过对小鼠外周血、淋巴细胞增殖程度、G-CSF活性的检测，观察加味当归补血汤对经环磷酰胺(CY)抑制的免疫功能低下荷瘤小鼠所具有的免疫功能重建作用，证明中医药可正向调节机体免疫功能，并为筛选出最佳的治疗剂量提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验动物采用昆明种小鼠，体质量(18±2)g，雌雄各半，由吉林大学实验动物中心提供，合格编号为SCXX(吉)-2011-0004。加味当归补血汤根据药典调配，按汤剂常规煎药2次后混合药液,浓缩成浸膏冰箱备用。中药饮片由长春中医药大学附属医院提供。环磷酰胺：每支200 mg，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号04090321。G-CSF试剂盒为武汉博士德生物有限公司产品。

1.2 实验分组与给药 60只清洁型昆明小鼠随机分为空白对照组、肿瘤组、环磷酰胺干预治疗模型组、加味当归补血汤高、中、低剂量治疗组，每组10只，雌雄各半。动物室室温在18～21 ℃,相对湿度在40%～60%，光照每日12 h，动物可自由进食饮水，实验环境符合GB 1495-94国家标准。除空白对照组外其余各组进行H22肝癌腹水瘤的接种。加味当归补血汤给药第8天开始对模型组、加味当归补血汤高、中、低治疗组进行小鼠腹腔注射环磷酰胺80 mg/kg[3]，隔日注射。中药灌服组小鼠按剂量分别灌胃给药，给药剂量按照小鼠临床等效计算所得，空白组、肿瘤组与模型组同时灌服生理盐水，连续14 d，给药组按体积为30 mL/kg体质量，1次/d灌服。中药灌服第8天开始空白对照组和肿瘤组小鼠注射等体积的生理盐水，其余各组小鼠按80 mg/kg腹腔注射环磷酰胺，隔日注射1次，共注射3次。

1.3 实验方法 小鼠RBC、WBC、Hb水平的测定：将昆明小鼠于第14天末次给药20 h后小鼠眼球取血，加入EDTA-Na2抗凝剂抗凝，用全自动血细胞分析仪测定计数情况。

1.4 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的测定 将昆明小鼠眼球取血，置于2 500 r/min离心机上，离心40 min后分离血清，放置-25 ℃冰箱保存,用ELISA法检测小鼠外周血G-CSF活性。

1.5 淋巴细胞转化实验 末次给药20 h后眼球取血脱颈处死,置于75%乙醇溶液中浸泡，无菌条件下取小鼠脾脏研磨,以3 mL Hank's液将脾细胞冲入无菌平皿中，覆盖16层纱布于细胞悬液上，过滤吸出细胞悬液离心洗涤1 000 r/min 15min，弃掉上清液加入3 mL完全1640营养液，调整脾细胞悬液1×106个/mL，取细胞悬液100 μL/mL加入96孔板并加入浓度为10 μg/mL的ConA 100 μL/mL(终浓度为5 mg/mL)同时设置ConA对照孔及空白对照孔，平行3复孔。将96孔细胞培养板置于37 ℃ CO2培养箱孵育68 h，培养终止前4 h每孔加入浓度为5 mg/mL MTT 10 μL继续37 ℃ CO2培养箱孵育4 h后800 r/min离心10 min弃上清液150 μL，每孔加入有机溶剂甲基亚砜(DMSO)100 μL及甘氨酸缓冲液20 μL，570 nm处酶标仪上测定OD值。

2 实验结果

2.1 加味当归补血汤对荷瘤小鼠红、白细胞水平及血红蛋白水平的影响 见表1。

表1 治疗后各组红、白细胞和血红蛋白水平的表达

注：与空白对照组比较，##P<0.01；与肿瘤组比较，△△P<0.01；与模型组相比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01

由表1可知,肿瘤组与空白对照组相比较红细胞、白细胞、血红蛋白水平降低(P<0.01)，表明荷瘤小鼠癌细胞接种成功。与肿瘤组相比较环磷酰胺干预治疗模型鼠的红细胞、白细胞、血红蛋白水平显著下降(P<0.01)，提示环磷酰胺造模成功。与模型组相比较，加味当归补血汤联合CY治疗的小鼠红细胞、白细胞、血红蛋白水平升高(P<0.05)，尤以加味当归补血汤中剂量组的白细胞水平显著的升高(P<0.01)，由此说明加味当归补血汤可使荷瘤小鼠CY化疗后红细胞、白细胞、血红蛋白水平回升，尤以中剂量效果最佳。

2.2 对小鼠淋巴细胞增殖能力的影响(MTT法) 见表2。

表2 治疗后各组淋巴细胞转化功能的表达

注：与空白对照组比较，##P<0.01；与肿瘤组比较，△△P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01

由表2可知，肿瘤组与空白组相比较P<0.01,提示荷瘤接种成功。模型组与肿瘤组相比较P<0.01，证明环磷酰胺干预治疗造模成功。加味当归补血汤高剂量组与模型组相比较P>0.05，差异无统计学意义。中、低剂量与模型组相比较P<0.05，差异具有统计学意义，由此说明加味当归补血汤中、低剂量可以促进淋巴细胞的增殖。

2.3 对小鼠粒细胞集落刺激因子的影响 见表3。

组 别数值空白对照组 16.406 6±0.562 65 肿瘤组 13.079 0±0.330 81##肿瘤CY组(模型组) 9.953 0±0.623 47△△高剂量治疗组 19.005 4±0.536 41▲ 中剂量治疗组 17.966 9±0.477 52▲▲低剂量治疗组 15.960 9±0.489 88▲

注：与空白对照组比较，##P<0.01；与肿瘤组比较，△△P<0.01；与模型组相比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01

由表3可知，肿瘤组与空白组相比较P<0.01,得知荷瘤接种成功。模型组与肿瘤组相比较差异有统计学意义(P<0.01)，得知环磷酰胺干预治疗模型成功。加味当归补血汤的高、中、低剂量治疗组与模型组相比较差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)，说明加味当归补血汤对小鼠的G-SCF活性具有明显的刺激回升，3组之间相比较得知中剂量效果最好，证明加味当归补血汤能够提高荷瘤小鼠经环磷酰胺化疗后的G-SCF活性，增强免疫力。

3 讨论

环磷酰胺(CY)是目前临床上广泛运用于治疗恶性肿瘤的烷化剂抗肿瘤药物，由于CY属于非特异性的烷化剂[3]，对肿瘤细胞和正常细胞无选择性的都具有杀灭的能力,因此在取得疗效的同时不可避免的带来了毒副作用，对全身多种组织器官造成杀伤尤以骨髓抑制更为明显。其中G-CSF水平下降可能是由于CY化疗后对机体的损伤造成的，G-CSF活性的降低可能与白细胞减少和骨髓抑制有关[4]。近年来,实验表明G-CSF对肿瘤化疗后引起的白细胞减少具有预防的作用,能够很大程度上改善化疗后白细胞下降的幅度[5]。

近年来红细胞与白细胞一样在免疫学研究方面已经成为不可忽视的免疫细胞，红细胞不仅具有识别、杀伤抗原与清除免疫复合物的作用而且还参与细胞因子网络的调控[6]。因此本研究采用荷瘤小鼠为研究对象,选用环磷酰胺干预治疗为实验模型，小鼠的RBC、WBC、Hb水平和G-CSF活性指标较正常小鼠和肿瘤组小鼠均下降,说明小鼠的免疫功能已处于抑制状态。腹腔注射CY并灌服加味当归补血汤的小鼠RBC、WBC水平、G-CSF活性较模型组有明显的改善提高，证明加味当归补血汤能改善或恢复机体的免疫功能。

加味当归补血汤由黄芪、当归、灵芝、阿胶、川芎等药物组成。方中黄芪为君药，具有增强自然杀伤细胞杀伤肿瘤细胞的能力[7],可强体抗癌，提高机体的免疫力。臣药用当归，与黄芪相辅相成,具有改善血供减轻炎症反应时的损伤[8]。阿胶大剂量使用能够提高骨髓的造血功能，促进健康人的淋巴细胞转化能力，通过补血提高体弱人群的免疫力，迅速补充疾病过程中消耗的气血阴液,提高免疫力，是不可缺少的治疗药物[9]。灵芝和川芎均可提高机体免疫力，达到防癌抗癌的目的，全方共奏气血相生之功。实验表明加味当归补血汤对小鼠免疫功能具有一定的恢复和增强作用，因此加味当归补血汤可以作为临床治疗肿瘤疾病过程中放化疗的辅助药物[10]。

[1]陈鹊汀,朱惠学,刘智勤,等.当归补血汤对肿瘤术后化疗增效减毒作用的临床观察[J].河北职工医学院学报,2008,25(5):54-55.

[2]李宝鸿,廉南.加味当归补血汤对肿瘤患者放化疗增效减毒作用的临床观察[J].成都中医药大学学报,2005(2):7-9.

[3]苏颖,郭焱,朱娜.益气方干预化疗所致免疫功能低下作用机理的研究[J].中国中医基础医学杂志,2010,12(12):1116-1117.

[4]李端.药理学[M].北京:人民卫生出版社,2007.

[5]陈旭芳.粒细胞击落刺激因子对肿瘤化疗患者白细胞数及医院感染的影响[J].中国肿瘤临床与康复,2009,6(3):196-197.

[6]郭焱,苏颖,顾红缨.运用益气方调节化疗所致红细胞减少症的作用机理研究[J].山西中医学院学报,2010,11(5):14.

[7]陈新谦,金有豫.新编药物学[M].北京:人民卫生出版社,2004:716.

[8]宋锦叶,盂立强,李晓攻.黄芪与当归的现代药理学研究进展[J].中国中西医结合肾病杂志,2008,9(9):833-835.

[9]苏颖,郭焱,刘智.益气方对化疗所致小鼠免疫功能影响的实验研究[J].长春中医药大学学报,2011,27(1):3-4.

[10]郭焱,苏颖,朱娜.益气加减方对化疗所致红白细胞减少症及免疫功能的影响[J].吉林中医药,2010,30(9):806-807.