白藜芦醇对肝癌细胞Bel-7402的抑制作用及其效应机制分析

赵丹懿，戴朝霞，陈骏，李丹Δ，高文涛

（1.大连医科大学附属第二医院肿瘤科，辽宁大连116023；2.南京医科大学，江苏南京210029）

白藜芦醇对肝癌细胞Bel-7402的抑制作用及其效应机制分析

赵丹懿1，戴朝霞1，陈骏1，李丹1Δ，高文涛2

（1.大连医科大学附属第二医院肿瘤科，辽宁大连116023；2.南京医科大学，江苏南京210029）

目的通过体内体外实验，观察白藜芦醇(resveratrol，Res）对肝癌细胞Bel-7402的增殖抑制作用，并对其抑癌的可能效应机制进行分析。方法实验中设4个Res药物组，终浓度分别为12.5、25、50、100μmol/L，同时设置不含Res药物的对照组，采用MTT法测试Res对体外培养肝癌Bel-7402细胞的增殖抑制作用，反转录PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR）检测Bcl-2 mRNA的表达，Western Blot检测Bcl-2蛋白的表达，ELISA测定Res对荷瘤小鼠细胞因子水平的影响。结果与对照组相比，Res可以呈剂量和时间依赖性方式抑制肝癌Bel-7402细胞的增殖和Bcl-2 mRNA及其蛋白的表达(P＜0.05）。同时Res能明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，并能明显升高荷瘤小鼠体内细胞因子IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α的水平(P＜0.05）。结论Res体内与体外对肝癌细胞Bel-7402均有明显的增殖抑制活性，其抗肿瘤的效应机制可能与其下调Bcl-2的表达和提高细胞因子IL-2、IL-6、IL-12及TNF-α的水平有关。

白藜芦醇；肝癌细胞Bel-7402；抑制作用；效应机制

肝癌是一种十分常见的恶性消化道肿瘤，其病死率高、危害性大，已经位居世界肿瘤性疾病的第3位，且有逐年升高的趋势［1-3］。中国是肝癌的高发区，其发病人数约占全世界总发病数的一半，而其死亡率也位居世界之首［4］。目前，治疗肝癌的首选方法是进行手术切除，约有40%的肝癌患者均采用手术切除治疗［5］。近年来，随着外科手术技术的快速发展，肝癌的手术治疗效果也在一定程度上得到改善。但是，肝癌术后复发率相当高，5年后复发率高达80%左右，患者的总体生存率并未得到明显提高［6］。因此，寻找和开发高效低毒的抗肝癌药物具有十分重要的意义。白藜芦醇（resveratrol，Res）作为一种天然的多酚化合物，广泛存在于葡萄、花生等天然植物中，具有显著的抗炎、抗自由基和抑制血小板凝聚等作用，对动脉粥样硬化和冠心病也有一定的预防作用［7］。有研究表明，Res能够抑制体外培养的多种人肿瘤细胞的增殖，同时对移植在小鼠体内的肿瘤细胞也显示出一定的增殖抑制活性［8］。目前，Res在治疗肝癌方面也有一定的研究，并显示出良好的应用前景，但其具体的作用机制并不十分清楚。本研究通过体内体外实验，观察白藜芦醇对肝癌细胞Bel-7402的增殖抑制作用，并对其抑癌的可能效应机制进行分析。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 白藜芦醇（Sigma公司，美国）；DMEM培养基、FBS胎牛血清（Hyclone公司，美国）；MTT噻唑蓝（Amresco公司，美国）；Trizol RNA试剂盒（Invitrogen公司，美国）；反转录酶（NEB公司，美国）；Taq DNA聚合酶（东盛生物科技有限公司，中国）；人Bcl-2单克隆抗体（中衫金桥公司，中国），羊抗兔二抗（DAKO公司，美国）。

1.2 实验细胞与动物 肝癌细胞Bel-7402购于美国ATTC公司，Bel-7402荷瘤小鼠购于中国科学院莱克实验动物中心，合格证号：S015732-21。

1.3 方法

1.3.1 肝癌Bel-7402细胞体外培养：Bel-7402细胞用含10%胎牛血清、青霉素105IU/L、链霉素100mg/L的DMEM高糖培养基于37℃，CO2体积分数为5%的细胞培养箱内培养。细胞融合到85%左右时，用0.25%胰酶消化，传代［9］。

1.3.2 MTT比色法测定肝癌Bel-7402细胞增殖：取对数生长期的细胞，以1×104个/mL的密度接种于96孔培养板中，每孔接种100μL，培养待细胞贴壁后，再加入用培养基稀释的不同浓度的Res药物100μL，Res的最终浓度为12.5、25、50、100 μmol/L，共4组，每组设置6个复孔，同时设置不含Res药物的对照组，也设置6个复孔。分别培养24 h和48 h后，每孔加入25 μL的MTT噻唑蓝，继续培养4 h后小心弃去培养液，再每孔加入150μL的DMSO，于摇床上振摇10 min，充分溶解生成的结晶，然后于490 nm波长处测定各组的光吸收值（OD值），重复3次，取均值。用下面的公式计算各组药物的细胞的抑制率［10-11］：抑制率=（1-药物组OD值/对照组OD值）×100%。

1.3.3 RT-PCR法检测肝癌Bel-7402细胞Bcl-2 mRNA的表达：肝癌Bel-7402细胞用Res作用培养48 h后，收集细胞，然后提取各组细胞总RNA，再立刻逆转录成cDNA，置于-20℃的冰箱保存备用。Bcl-2 mRNA的扩增实验操作按照RT-PCR试剂盒的说明进行，反应体系为50μL，94℃下先预变性5 min，然后按照94℃30 s，56℃60 s，72℃120 s，反复进行30个循环，最后在72℃下延伸10min。然后取RT-PCR的产物10μL进行电泳，相对分子质量标准采用puc Mix Marker，使用凝胶扫描系统扫描目的基因和β-actin基因的光密度值，目的基因光密度与β-actin基因光密度的比值反映该目的基因mRNA的表达水平。

1.3.4 Western blot法检测肝癌Bel-7402细胞Bcl-2蛋白的表达：肝癌Bel-7402细胞用Res作用培养48 h后，收集细胞，然后提取各组细胞蛋白。取煮沸后的蛋白质样品用SDS-PAGE电泳分离，然后转移至Millipore膜。用脱脂奶粉封闭1 h后，用Bcl-2单克隆抗体孵育，紧接着用二抗孵育，采用ECL放射自显影。最后将胶片扫描，分析目标带的分子量和光密度值，β-actin作为内参对照，2者光密度比值即为目的蛋白的相对表达水平。

1.3.5 肝癌Bel-7402荷瘤小鼠建模：将正常培养的肝癌Bel-7402细胞制成悬液，注射进80只小鼠体内。然后随机分为对照组和实验组，每组各40只。实验组小鼠再分为4组，每组各10只，按照25、50、100、200mg/kg的Res剂量进行灌胃，对照组每日用相同体积的蒸馏水灌胃。每隔1周测量肿瘤的体积。

1.3.6 ELISA法检测细胞因子水平：采用双抗体夹心法检测细胞因子IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α的水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件包建立数据库并进行统计分析。所有资料行正态分布检验，呈正态分布的计量资料以±s”表示，非正态分布的计量资料以中位数和四分位间距M（Q3-Q1）表示；正态资料组间比较采用t检验，等级资料组间比较采用秩和检验，样本率的比较采用卡方检验分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法测试Res对体外培养肝癌Bel-7402细胞的增殖抑制作用 由图1可知，与对照组相比，Res呈剂量和时间依赖性抑制体外培养肝癌细胞Bel-7402的增殖（P＜0.05）。由图2可知，对照组细胞形态正常，密度大，Res组的细胞，随着浓度的不断增大，Bel-7402细胞出现了典型的凋亡特征：细胞的染色质固缩，且出现了凋亡小体。

图1 Res对肝癌Bel-7402细胞的增殖抑制Fig.1 The inhibition of Res on Bel-7402

图2 不同浓度Res作用48 h后肝癌Bel-7402细胞的形态变化（SP×400）A：对照组细胞；B：12.5μmol/L Res组；C：25μmol/L Res组；D：50μmol/L Res组；E：100μmol/L Res组Fig.2 Themorphological changes of Bel-7402 cells after 48 h of different concentrations of Res（SP×400）A：Control group；B：12.5μmol/L Res group；C：25μmol/L Res group；D：50μmol/L Res group；E：100μmol/L Res group

2.2 RT-PCR法检测Res对体外培养肝癌Bel-7402细胞Bcl-2 mRNA表达的影响 使用RT-PCR法检测对照组和Res组Bel-7402细胞中Bcl-2 mRNA的表达情况。由图3检测结果所示，Res组Bcl-2 mRNA的表达显著低于对照组，其中100μmol/L Res组表达最低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 Res对肝癌Bel-7402细胞Bcl-2 mRNA表达的影响M：DNA分子量标准；1.100μmol/L Res组；2.50μmol/LRes组；3.25μmol/L Res组；4.12.5μmol/L Res组Fig.3 Effects of Res on the expression of Bcl-2 mRNA in Bel-7402 cellsM：Standard of DNA molecular weight；1.100μmol/L Res group；2.50μmol/L Res group；3.25μmol/LRes group；4.12.5μmol/L Res group

2.3 Western Blot法检测Res对肝癌Bel-7402细胞Bcl-2蛋白表达的影响 由图4 Western Blot的实验结果可知，与对照组相比，肝癌Bel-7402细胞的Bcl-2蛋白表达明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），说明Res抑制了Bel-7402细胞Bcl-2的蛋白表达。

图4 Res对肝癌Bel-7402细胞Bcl-2蛋白表达的影响Fig.4 Effects of Res on the expression of Bcl-2 protein in Bel-7402 cells

2.4 Res对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制 由表1可知，与对照组相比，Res能显著抑制荷瘤小鼠移植性肝癌细胞Bel-7402的生长，肿瘤重量比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 Res对Bel-7402荷瘤小鼠肿瘤生长的影响Tab.1 Effects of Res on tumor growth ofmice with Bel-7402 tumor

2.5 ELISA法测定Res对荷瘤小鼠细胞因子的影响 由表2可知，与对照组相比，Res组荷瘤小鼠血清中的IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α的水平明显升高，有显著性差异（P＜0.05）。

表2 Res对Bel-7402荷瘤小鼠血清细胞因子水平的影响Tab.2 Effect of Res on cytokine levels ofmice with Bel-7402 tumor

3 讨论

细胞凋亡能够清除体内老化变异的细胞，从而维持机体的稳定。当在基因水平上失去对某个细胞的正常调控时往往就会导致肿瘤的发生。故而，细胞凋亡机制对于肿瘤的发生发展具有十分重要的意义。有研究显示，白藜芦醇能够诱导肿瘤细胞的分化凋亡，但其具体的作用机制并不十分清楚。本研究通过体内体外实验，观察白藜芦醇对肝癌细胞Bel-7402的增殖抑制作用，并对其抑癌的可能效应机制进行分析。研究发现，无论是在体内还是在体外，白藜芦醇对肝癌Bel-7402的增殖都显示出了良好的抑制活性。此外还发现白藜芦醇下调了Bel-7402细胞Bcl-2的表达。Bcl-2是一种十分重要的细胞凋亡调控基因，位于线粒体膜和内质网上，它能够抑制细胞发生凋亡，从而导致肿瘤的发生［12-13］。所以，白藜芦醇下调Bcl-2的表达，可能就是其抑制Bel-7402细胞增殖并诱导其凋亡的原因。

机体免疫调节发生紊乱也是导致肝癌的重要因素，而导致免疫异常通常是由于血清细胞因子的作用。本研究发现，白藜芦醇治疗组的荷瘤鼠血清中IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α的水平升高。而IL-2是调节机体免疫功能中最重要的细胞因子，它能够诱导免疫T细胞的增殖和促进淋巴B细胞的免疫应答，从而发挥抗肿瘤的作用。IL-6和IL-12也能够诱导免疫T细胞和自然杀伤细胞NK的产生［14-15］。大量的实验表明，IL-6和IL-12具有广泛的抑瘤作用，甚至可以促进肿瘤转移病灶的消退［16-17］。此外，TNF-α作为一种肿瘤抑制因子，具有直接杀伤或抑制肿瘤的作用，也能够促进免疫T细胞和其他杀伤细胞对肿瘤的杀伤力，可以作用于肿瘤血管，造成肿瘤血管的损伤，从而“饿死”肿瘤［18］。

总之，本研究证实白藜芦醇能够在体内体外移植肝癌Bel-7402细胞的增殖。初步阐明了白藜芦醇通过下调细胞Bcl-2的表达，提高IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α的水平发挥抗肿瘤的作用。这对于开发白藜芦醇衍生物类的抗癌药物具有十分重要的意义。

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（编校：谭玲）

The inhibition and possiblemechanism of resveratrol on hepatocellular carcinoma cell line Bel-7402 both in vitro and vivo

ZHAO Dan-Yi1，DAIChao-xia1，CHEN Jun1，LIDan1Δ，Gao Wen-tao2

（1.Department of Oncology，The Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116023，China；2.Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo explore the inhibition effect and the possiblemechanism of resveratrol on human hepatocellular carcinoma cell line Bel-7402 both in vitro and vivo.MethodsFour Res drugs in the experiment group，the final concentrations were 12.5，25，50，100μmol/L，the control group at the same time setnot containing Res drugs，MTT assaywas used tomeasure the inhibition of resveratrolon Bel-7402.The expression of Bcl-2 was detected by RT-PCR and Western Blot.The levels of IL-2，IL-6，IL-12 and TNF-αwere detected by ELISA.Results Resveratrol inhibited Bel-7402 cell proliferation in dose and timemanner，and influenced the expression of Bcl-2 mRNA and protein.At the same time，resveratrol inhibited the growth of tumor and improved the levels of IL-2，IL-6，IL-12 and TNF-α.Conclusion Resveratrol could inhibit Bel-7402 cell proliferation both in vitro and vivo，the possiblemechanism may be that resveratrol could low down the expression of Bcl-2 and improve the levels of IL-2，IL-6，IL-12 and TNF-α.

resveratrol；hepatocellular carcinoma cell line Bel-7402；inhibition；mechanism

R735.7

A

1005-1678(2014）07-0006-04

国家自然科学基金项目计划书（81172267）

赵丹懿，男，博士，副主任医师，研究方向：消化系统肿瘤的介入治疗，E-mail：qch1821460048@163.com；李丹，通信作者，女，博士，主治医师，研究方向：恶性肿瘤多药耐药及侵袭转移机制临床与基础研究，E-mail：qch1821460049@163.com。