全反式维甲酸对U251细胞系增殖和MAPK信号通路的影响

师丽娜，臧峰，周国平

（1.淄博市第一医院医务科，山东淄博255200；2.淄博市第一医院普外科，山东淄博255200；3.南京医科大学，江苏南京210029）

全反式维甲酸对U251细胞系增殖和MAPK信号通路的影响

师丽娜1，臧峰2，周国平3

（1.淄博市第一医院医务科，山东淄博255200；2.淄博市第一医院普外科，山东淄博255200；3.南京医科大学，江苏南京210029）

目的探讨全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA）对U251细胞系增殖和MAPK信号通路的影响。方法使用不同浓度的ATRA溶液对脑胶质瘤细胞U251进行孵育，检测ATRA对U251细胞增殖的影响，并通过qRT-PCR与Western blot方法检测MKPs与MAPK信号通路中各蛋白的变化。结果与对照组相比，ATRA可以有效的抑制脑胶质瘤细胞U251的增殖，并且具有浓度依赖性。qRT-PCR结果显示，采用不同浓度ATRA孵育48h后，MKPsmRNA的表达发生改变，但是MKP-5变化情况与下调67LR表达时不同，说明2种方法对MAPK信号通路作用的主要区别是对MKP-5的调控。Western blot实验结果表明，ATRA孵育48h后，MAPK信号通路中各蛋白的磷酸化发生变化，说明ATRA通过控制MAPK信号通路中蛋白的磷酸化程度对U251细胞系进行调控。结论维甲酸通过与不同的维甲酸受体相结合，发挥其生理作用，对脑胶质瘤细胞U251进行调控。ATRA可通过降低磷酸化ERK1/ 2的表达来抑制肿瘤的增殖，且能调控3种蛋白的磷酸化，说明MAPK信号通路在肿瘤增殖过程中发挥重要作用。

胶质瘤；67LR；ATRA

全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）与受体通过配体结合区域相互结合，作用于靶基因。这是维甲酸类药物作用的经典途径。维甲酸结合受体包含DNA结合区域，可以识别基因组DNA的特异性序列［1］。维甲酸靶基因启动子序列中包含有维甲酸受体反应元件，通过受体和靶基因之间不同的作用方式，维甲酸类药物可以调节细胞中不同基因或酶的表达，使其活化或抑制，从而达到治疗目的［2-4］。目前研究证实维甲酸还可以通过受体抑制转录活性因子AP-1（活性蛋白-1）途径抑制某些细胞增殖［5］。通常它的活性形式为Jun与Fos家族成员的同源或异源异二聚体，能够刺激肿瘤的形成，在肿瘤的侵袭与浸润中起到关键作用。维甲酸类药物可以与c-Jun（属于活性蛋白-1）相互作用，导致其失活，而实验证明AP-1的表达抑制可以抑制肿瘤的形成［6］。

ATRA不仅具有抑制肿瘤生长的作用，在阻断肿瘤的血管生成中也扮演着重要的角色。肿瘤组织新生血管的生成与癌组织侵袭、转移程度成正比［7］。有研究表明ATRA可以明显抑制血管平滑肌细胞的增殖，下调TGF-β基因表达，降低血纤维蛋白酶原激活物的活性，使血纤维蛋白酶原激活物抑制物PAI-1的表达上调［8］。此外ATRA可以减少原胶原Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，纤维结合素的合成，从而降低了肿瘤细胞的移动能力［9］。

维甲酸通过与不同的维甲酸受体相结合，发挥其生理作用，因此它对于脑胶质瘤细胞U251的调控网络非常复杂。MAPK信号通路中蛋白的磷酸化表明，ATRA与67LR不同，不仅降低磷酸化ERK1/2的表达来抑制肿瘤的增殖，而且对3种蛋白的磷酸化全部产生调控，因此其作用机制会更加复杂，同时也说明MAPK信号通路在肿瘤增殖过程中扮演着至关重要的角色，在此背景下，本文深入地探讨了维甲酸对U251细胞系增殖和MAPK信号通路的影，以期能为将来的研究提供一些参考。

1 材料与方法

1.1 实验细胞与标本 人恶性脑胶质瘤细胞系U251购自中国科学院生命科学研究院。胶质瘤标本及正常脑组织对照标本均取自仁济医院。

1.2 实验试剂与药品 混合纤维素酯微孔滤膜（0.22 μm），细胞培养用细菌过滤器（100 mm）（上海百特）。6孔细胞培养板，24孔细胞培养板，96孔细胞培养板，35 mm培养皿，60 mm培养皿，15 mL无菌尖头离心管，50 mL无菌尖头离心管（Corning）。

青霉素，链霉素，DMEM，胎牛血清，胰蛋白酶，DMSO，poly-D-lysine，DMEM细胞培养基11995（Gibco）。X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent（Roche）。多聚甲醛，TritonX-100，异丙醇，琼脂糖，氯仿（华美）。DNAMarkers，TotalRNA Extractor-Trizol［生工®生物工程（上海）有限公司］。PrimeScript®RT Master Mix Perfect Real Time，SYBR®Premix Ex Taq：trademark：GC（Perfect Real Time），PCR DNA Markers，T4 DNA Ligase，StuⅠ酶（TaKaRa公司）。Silen CircleTMRNAi Transcription Kit（美国绿阳公司）。Cell Counting Kit-8（DOJINDO公司）。ECL试剂（Millipore公司）。Western及IP细胞裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）。DH5α感受态细菌、质粒小抽试剂盒、质粒无内毒素大抽快速提取试剂盒（TIANGEN）。

一抗：兔抗人ERK1/2、p38、JNK，磷酸化ERK1/2，磷酸化p38以及磷酸化JNK；多克隆抗体（Cell Signaling）。小鼠抗人67LR单克隆抗体（Abcam®）。二抗：连有过氧（化）物酶的羊抗兔-IgG，连有过氧（化）物酶的羊抗小鼠-IgG（KANG CHEN）。

1.3 实验方法

1.3.1 ATRA溶液配制：①称取100 mg维甲酸粉末溶于332.845mL无水乙醇；②使用孔径为0.22μm的微孔滤膜进行过滤；③密封，-70℃避光保存，母液浓度为1000μM；④使用时，用无血清培养基稀释至需要的浓度，现配现用。

1.3.2 细胞分组和ATRA处理：①使用无血清培养基对ATRA母液进行稀释，配制成工作液，浓度分别为0.1μM，0.5 μM，1μM，5μM，10μM，50μM，6个浓度；②从培养箱中取出24 h前接种的细胞，吸去培养基；③依次向细胞中加入不同浓度的ATRA溶液（依据培养板的大小，选择加入ATRA溶液的体积）；④将培养板放入培养箱中，细胞在37℃，5%CO2饱和湿度下常规培养48 h后，进行后续试验。实验分7组，A组为空白对照组，未进行ATRA孵育；实验组分为B组以50μM浓度孵育U251细胞；C组以10μM浓度孵育U251细胞；D组5 μM浓度孵育U251细胞；E组以1μM浓度孵育U251细胞；F组以0.5μM浓度孵育U251细胞；G组以0.1μM浓度孵育U251细胞。

1.3.3 脑胶质瘤细胞系U251的培养与转染：将含细胞的冻存管从-80℃冰箱或液氮中取出，立即置于40℃水浴中轻轻振荡1min左右，使冻存液溶解，从水浴中拿出，喷洒70%乙醇后，将细胞转移入5 mL细胞培养基中，离心收集细胞沉淀，加培养基混匀，移入培养皿中。37℃，5%CO2培养，待细胞贴壁后，更换新培养液；加入2mL新鲜培养液，用枪轻轻吹打，再加入适量培养液以易于混匀细胞；取1mL细胞悬液加入装有2 m L新鲜培养基的新培养皿中，放入37℃，5%CO2培养箱中培养，约3 d左右传代1次；从培养箱中取出培养板，并吸净培养基，再将已孵育好的复合物加入到每一个待转细胞的孔中，每孔50μL，轻轻前后摇动培养板混合。细胞在37℃，5%CO2饱和湿度下常规培养48 h，观察转染结果并拍摄荧光以及常光照片。

1.3.4 细胞增殖检测实验：在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（37℃，5%CO2）；待细胞汇合度达到70%～80%时，使用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent进行转染；48 h后，取出培养板，向每孔中加入6.5μL的CCK-8溶液；将培养板放回培养箱内，孵育4h；用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.3.5 Quantitative real-time PCR：将总RNA溶液吸取1～2μL置于Nanodrop 2000的探头上，闭合探头，开始测定，得到260 nm和280 nm波长分别测吸光值（A）与A260/A280的值以及RNA溶液的浓度；使用Graph Prism 5.0软件计算mRNA的相对表达量。

1.3.6 Western blot：用PBST清洗封闭后的膜4次，每次5min，尽量不要有残余物；加入一抗室温孵育2 h后，用PBST清洗3次，每次5min；加入二抗室温孵育1 h后，用PBST清洗3次，每次5min；显色：取ECL试剂盒中试剂A和试剂B各500μL，混匀后，润湿膜，使其反应1min；将膜放入压片盒中，用X感光片感光约5～60 s。经显影、停影、定影和水洗后，晾干。

1.4 统计学方法 实验结果用Graph Prism 5.0软件定量分析。实验结果用“±s”表示。多样本均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ATRA孵育对U251细胞系的影响 结果显示，在完全相同的培养条件下培养48 h，未做任何处理的空白对照组（图1A）的OD值为（2.27312±0.0815），ATRA孵育浓度为50 μM的实验组（图1B）OD值为（0.185±0.073），2组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；0.1μM浓度的实验组的OD值（2.302±0.094），相比空白对照组差异无统计学意义。结果表明：ATRA对胶质瘤细胞系U251的生长、增殖有明显的抑制作用，并且具有浓度依赖性。

图1 不同浓度ATRA对胶质瘤细胞U251的影响A：空白对照组；B：50μM浓度孵育48 h；C：10μM浓度孵育48 h；D：5μM浓度孵育48 h；E：1μM浓度孵育48 h；F：0.5μM浓度孵育48 h；G：0.1μM浓度孵育48 h标尺为50μmFig.1 Effects of different concentrations of ATRA on glioma cell U251A：control group；B：50μM ATRA with 48 h；C：10μM ATRA with 48 h；D：5μM ATRA with 48 h；E：1μM ATRA with 48 h；F：0.5μM ATRA with 48 h；G：0.1μM ATRA with 48 h Barmeans 50μm

2.2 qRT-PCR分析ATRA孵育对MKPs的影响 使用qRT-PCR分析ATRA孵育48h后，胶质瘤细胞系U251中4类MKPs的mRNA的变化如图2。结果表明，MKP-1的mRNA表达在ATRA浓度为1μM时，达到最大值，但是随着ATRA浓度的继续增大，MKP-1 mRNA的表达出现了显著的下降。结果表明，ATRA在发挥抑制肿瘤生长作用时会引起MKPs各成员mRNA表达的变化，提示ATRA可能通过MAPK信号通路抑制U251细胞系的增殖。

2.3 Western blot检测ATRA孵育后对MAPKs的影响 为进一步研究ATRA对人脑胶质瘤细胞U251中MAPK信号通路中各蛋白及其磷酸化的影响，使用Western blot来进行检测ATRA孵育48h之后ERK1/2，p38，SAPK/JNK，磷酸化ERK1/2，磷酸化p38与磷酸化SAPK/JNK的蛋白变化情况［10］。如图3所示，β-actin为内参，CON为空白对照组。

图3 胶质瘤细胞U251中MAPKs各蛋白与磷酸化MAPKs各蛋白的表达变化Fig.3 Expressin changes of proteins and phosphorylated proteins of MAPKs in glioma cell line U251 in vitro

当以不同浓度ATRA孵育48 h之后，ERK1/2，p38，SAPK/ JNK的总蛋白量并没有出现大的变化，但是磷酸化ERK1/2，磷酸化p38与磷酸化的SAPK/JNK的表达情况却出现了明显的差异，磷酸化ERK1/2在0.5与1.0μM时都表现出明显的下降，但是当ATRA的浓度为5μM时，磷酸化ERK1/2出现了明显的升高，说明负责调控ERK1/2磷酸化的MKPs表达在ATRA浓度为5μM时，出现下降，此结果与前面的研究一致。当孵育浓度达到10μM时磷酸化ERK1/2的表达继续出现下降，而且细胞的增殖能力也出现明显降低，说明ERK1/2的磷酸化与U251细胞的增殖密切相关，ERK1/2磷酸化的减弱会抑制U251细胞的增殖；磷酸化p38的表达仅在ATRA浓度达到10μM时，出现明显下调；磷酸化SAPK/JNK的情况比较复杂，在不同浓度时，都会呈现出不同的磷酸化情况，但当孵育浓度为0.5μM时，去磷酸化作用明显。这一结果说明，随着ATRA浓度的变化，MAPK信号通路中各蛋白通过不同的磷酸化程度调控细胞的生理功能。

3 讨论

在ATRA孵育的情况下，U251细胞的增殖也呈现出被抑制的趋势，并且具有浓度依赖的特点。由于未进行细胞毒性检测，ATRA对胶质瘤细胞的生长、增殖产生抑制的机制尚需要进一步研究。

为了研究ATRA孵育对MAPK信号通路的影响，在不同浓度ATRA孵育的情况下，本研究使用qRT-PCR与Western blot检测MKPs与MAPKs的表达变化。结果表明，当ATRA浓度为0.1 μM时，U251细胞无论在增殖，细胞数量还是细胞形态方面，同空白对照组相比，均未出现明显差异；当ATRA浓度达到50μM时，几乎不存在具有活性U251细胞，因此在qRT-PCR与Westernblot检测中，选取0.5μM，1.0μM，5.0μM与10.0μM 4个浓度，进行孵育。结果显示，MKP-5的情况与下调67LR基因时不同：ATRA浓度越高，mRNA的表达越少；但是MKP-3与PAC1的情况与下调67LR基因时一致。说明2种方法虽然均可抑制肿瘤细胞的增殖，但对MAPK信号通路的作用并不相同，而其中主要的区别在于对MKP-5mRNA（或与MKP-5同属一类的MKPs）表达的调控。Western blot的结果表明ATRA对于MAPK信号通路的调控不单纯的局限于控制磷酸化ERK1/2的表达，对磷酸化p38与磷酸化SAPK/JNK都起到调控的作用，这一结果提示，ATRA与67LR可能对MAPK信号通路的调节会产生交互作用，但是对肿瘤细胞增殖的影响，需要进一步深入研究。

下调67LR与ATRA孵育对MAPK信号通路中MKP-1的表达也不同。当ATRA浓度为1μM时，达到最大值，但在5μM时出现明显的下降，说明ATRA对于MKP-1 mRNA表达的调控可能存在一种反馈抑制的机制，当ATRA溶液达到一定浓度时，导致MKP-1 mRNA表达的抑制。表明ATRA与67LR通过MAPK信号通路对肿瘤细胞增殖进行调控的分子机制不同。

维甲酸通过与不同的维甲酸受体相结合，发挥其生理作用，因此它对于脑胶质瘤细胞U251的调控网络非常复杂［11］。MAPK信号通路中蛋白的磷酸化表明，ATRA与67LR不同，不仅降低磷酸化ERK1/2的表达来抑制肿瘤的增殖，而且对3种蛋白的磷酸化全部产生调控，因此其作用机制会更加复杂［12］，同时也说明MAPK信号通路在肿瘤增殖过程中有着重要作用。

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（编校：吴茜）

Retinoic acid incubation effect on proliferation of U251 cell line and effect on MAPK signal pathway

SHILi-na1，ZANG Feng2，ZHOU Guo-ping3

（1.Department of Medical Services，the First Hospital of Zibo City 255200 China；2.Department General Surgery，the First Hospital of Zibo City 255200 China；3.Nanjing Medical University，Nanjing 210029 China）

ObjectiveTo investigate the retinoic acid incubation effect on proliferation of U251 cell line and effect on MAPK signal pathway.MethodsATRA solution of different concentration on the U251 glioma cells were incubated，the influence of ATRA on the proliferation of U251 cells were detected，and the proteins of MKPs and MAPK signaling pathwayswere detected by qRT-PCR and Western blot.Using Graph Prism 5 software for quantitative analysis ofexperimental results.ResultsCompared with control group，ATRA could effectively inhibit the proliferation of U251 glioma cells，in a concentration dependentmanner.QRT-PCR results showed that，different concentrations of ATRA after incubation for 48 hours，the expression of MKPsmRNA changed，but the changes of MKP-5 and expression of67LR was different，explained themain differences between the twomethods of the MAPK signaling pathway was the regulation of MKP-5.Western blot results showed that the ATRA，after 48 hours of incubation，the protein MAPK pathway had changed in phosphorylation，which showed that ATRA protein in the MAPK signaling pathway through control of the degree of phosphorylation on U251 cell line regulation.ConclusionRetinoic acid and retinoic acid receptor play its physiological effects and regulate human glioma cell line U251proliferation through different combination.Retinoic acid could not only reduce the expression of phosphorylated ERK1/2 to inhibit tumor proliferation，but also regulate three kinds of protein phosphorylation，therefore itsmechanism will be more complex，at the same time that the MAPK signaling pathway plays a crucial role in tumor proliferation process.

glimoa；67LR；ATRA

R739.41

A

1005-1678(2014）07-0019-04

国家自然科学基金（81170611）

师丽娜，女，硕士，主治医师，研究方向：血液病学，E-mail：qch1821460063@163.com。