枸杞多糖对大鼠海绵体神经钳夹损伤的修复作用

张树红，陈华，王克强，张永慧，刘子龙

（1.莱芜市妇幼保健院药剂科，山东莱芜271199；2.莱芜职业技术学院医学系，山东莱芜271199；3.华中科技大学基础医学，湖北武汉430074）

枸杞多糖对大鼠海绵体神经钳夹损伤的修复作用

张树红1，陈华1，王克强1，张永慧2，刘子龙3

（1.莱芜市妇幼保健院药剂科，山东莱芜271199；2.莱芜职业技术学院医学系，山东莱芜271199；3.华中科技大学基础医学，湖北武汉430074）

目的探讨使用枸杞多糖(lyceum barbarum polysaccharides，LBP）修复钳夹损伤的海绵体神经(cavernous nerve，CN）恢复自主勃起功能的可能性。方法140只雄性SD大鼠随机均分成5组，即假手术组、损伤对照组及实验A、B、C组，实验A、B、C组分别于CN钳夹损伤后1、7、14 d给予LBP灌胃2周，于术后1周、2周、4周、12周每组随机取7只大鼠进行血清丙二醛(MDA）含量、超氧化物歧化酶(SOD）活性和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX）活性测定，术后12周电刺激海绵体神经，测定海绵体内压(intracavernous pressure，ICP）及平均动脉压(mean arterial pressure，MAP），随后取海绵体神经干进行甲苯胺蓝染色记录CN有髓轴突数目，再取阴茎组织进行NADPH染色记录阴茎背神经NOS阳性神经纤维数目。结果在第1周和第2周，实验A组SOD和GPX活性均显著高于其它4组(P＜0.05）；在第2周和第4周，实验A组MDA含量明显低于其它4组(P＜0.05）；在第12周，实验A组ICP值及ICP/MAP比值、海绵体神经有髓鞘轴突数目及阴茎背神经NADPH染色阳性神经纤维数目均显著高于损伤对照组及实验B组和实验C组(P＜0.05），但均低于假手术组(P＜0.05）。结论在CN钳夹损伤后的前2周应用LBP可促进CN的再生和勃起功能的恢复，其机制可能与LBP通过其抗氧化作用减轻氧化应激诱导的神经元损伤有关。

勃起功能障碍；枸杞多糖；海绵体神经；氧化应激

阴茎勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）是指阴茎持续不能达到或维持足够的勃起以获得满足的性生活（性交）［1］。尽管ED不是一种危及生命的疾病，但与患者的身心健康密切相关，对患者及家人的生活质量及家庭的稳定性均可产生重大影响［2］。前列腺癌根治术等盆腔手术术后常会并发ED，而通常认为术中损伤支配阴茎勃起功能的海绵体神经（cavernous nerves，CN）是并发ED的主要原因［3］。术中在分离直肠前壁与前列腺、离断前列腺韧带及膀胱侧韧带、游离前列腺尖部及横断尿道时容易损伤CN，从而导致ED的发生［4］。随着前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）检测应用于前列腺癌的初期筛查后，越来越多的前列腺癌患者被发现，尤其是年轻患者，希望术后保持阴茎正常勃起功能的患者也越来越多［5］。因此针对盆腔手术中保护阴茎勃起功能和术后恢复勃起功能的各种研究成为泌尿外科和男科学的研究热点和难点［6］。本实验将LBP用于双侧CN钳夹损伤后的大鼠，通过进行血清氧化应激指标检测和与勃起功能相关的形态学和功能学指标检测，探讨LBP能否通过其抗氧化机制促进CN再生修复和勃起功能恢复。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂 甲苯胺蓝（上海试剂三厂）；还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2′-磷酸（NADPH）、硝基四氮唑蓝（NBT）、Triton X-100（美国Sigma公司）；OCT包埋剂、EMbed 812包埋剂（北京中杉生物试剂公司）；MDA试剂盒、SOD试剂盒、GPX试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 主要设备 SXP-1C型手术显微镜（上海医用仪器厂）；HC-X020显微血管夹（宁波市成和显微器械厂）；BL420-F生理记录仪（成都泰盟科技有限公司）；超薄切片机（德国Leica公司）；CM1900恒冷箱式冰冻切片机（瑞典LKB II公司）；OLYMPUS-DP12显微镜（日本OLYMPUS公司）；722型分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；恒温水浴箱（南京泰斯特试验设备有限公司）；AG-204分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；BFX5-320型离心机（河北白洋离心机厂）；真空冷冻干燥机（台湾泛达仪控有限公司）。

1.3 实验动物及分组 140只SPF级雄性SD大鼠，3月龄，体质量250～300 g，购于武汉大学实验动物中心，许可证号：SCXK（鄂）2008-0004，均经性交配实验证实有正常性功能。将140只SD大鼠随机分为5组，假手术组28只，仅游离海绵体神经3mm而避免损伤；损伤对照组28只，游离海绵体神经约3mm后，用显微血管夹钳夹双侧CN各2min；实验A、B、C组各28只大鼠，经过与损伤对照组相同的双侧CN钳夹损伤处理后，分别于术后1、7、14 d起给予LBP灌胃2周。本实验遵循《实验动物保护条例》。

1.4 实验方法

1.4.1 钳夹损伤模型的建立：在无菌状态下，大鼠用1%的戊巴比妥按50mg/kg剂量经腹腔注射麻醉后固定于鼠台上，备皮、消毒后，取下腹部正中切口逐层打开至盆腔，延长切口至阴茎根部，用显微血管夹钳夹CN 2min后松开显微血管夹。用同样的方法找到对侧的CN并用显微血管夹钳夹CN 2min，取出显微血管夹后逐层关腹。假手术组仅于前列腺表面找到CN而不进行钳夹损伤。实验A、B、C组分别于术后1、7、14 d起每天按10mg/kg的剂量给予LBP灌胃，连续灌胃2周，假手术组及损伤对照组不灌胃。

1.4.2 氧化应激指标测定：分别于术后1、2、4、12周每组各随机取7只大鼠，经心脏采血提取血清，测定大鼠血清丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性，评价氧化应激水平。术后12周的大鼠先进行勃起功能测定再行心脏采血。所有大鼠采血后均采用颈椎脱臼法处死。

1.4.3 阴茎勃起功能测定：术后12周各组7只大鼠均通过电刺激CN促使海绵体充血勃起，然后进行阴茎海绵体内压（intracavernous pressure，ICP）及平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）测定。

1.4.4 海绵体神经甲苯胺蓝染色：取钳夹处远端3mm的海绵体神经甲苯胺蓝染色，在显微镜下观察CN整个横切面轴突的数目。

1.4.5 阴茎组织NADPH黄递酶染色：CN取出后，立即取阴茎中段组织进行NADPH黄递酶染色。将阴茎组织取出后用OCT包埋，用冰冻切片机行冰冻切片，切片8μm厚。将切片放置于空气中干燥5 min后，用含有0.2%Triton X-100、1 g/Lβ-NADPH、0.8 g/L硝基四氮唑蓝（NBT）的0.1mol/L（pH 8.0）PBS溶液，在37℃温箱中孵育3～4 h。在显微镜观察确认染色成功后，用0.01mol/L（pH7.4）的PBS溶液终止反应，并用0.01mol/ L（pH7.4）的PBS漂洗数次，之后依次80%、90%、95%、100%浓度的酒精进行梯度脱水，二甲苯透明，晾干后中性树胶封片。将切片放在OLYMPUS-DPl2显微镜下放大400倍拍片，记录双侧阴茎背神经中NADPH-黄递酶阳性神经纤维的数目。

2 结果

2.1 血清氧化应激水平 5组大鼠均在术后第1周、2周、第4周和第12周测定血清MDA含量、SOD活性和GPX活性，评估氧化应激水平。如表1中所示，术后第1周，5组大鼠血清MDA水平没有显著性差异，在第2周和第4周，实验A组MDA含量明显低于其它4组（P＜0.05），第2周实验B组的MDA含量低于实验C组（P＜0.05），第4周实验B组和实验C组之间MDA水平没有显著性差异。

表1 各组大鼠在术后不同时间点血清MDA含量比较Tab.1 Comparison of serum MDA content at different time after operation in each group

如表2、表3所示，在第1周和第2周，实验A组SOD和GPX活性均显著高于其它4组（P＜0.05），在第2周，实验B组SOD和GPX活性均显著高于实验C组、假手术组和损伤对照组（P＜0.05），第4周，3个实验组的SOD和GPX活性均高于假手术组和损伤对照组（P＜0.05），但3个实验组之间差异无统计学意义。在第12周，5组大鼠之间血清MDA含量、SOD和GPX活力差异无统计学意义。

表2 各组大鼠在术后不同时间血清SOD活性比较Tab.2 Comparison of serum SOD activity at different time after operation in each group

表3 各组大鼠在术后不同时间血清GPX活性比较Tab.3 Comparison of serum GPX activity at different time after operation in each group

2.2 ICP和ICP/MAP比值 在第12周测定阴茎充血勃起指标ICP峰值，评估阴茎勃起功能。如图1所示，损伤对照组与假手术组相比，ICP峰值及ICP/MAP比值均显著降低（P＜0.05），为阴茎勃起功能障碍状态。实验A组ICP峰值和ICP/MAP比值均显著高于损伤对照组和其它2个实验组（P＜0.05），但低于假手术组（P＜0.05）。与实验C组比较，实验组B具有更高的ICP峰值和ICP/MAP比值（P＜0.05）。实验C组和损伤对照组之间ICP峰值和ICP/MAP比值没有显著差异。

图1 术后第12周电刺激海绵体神经评估勃起功能A：各组大鼠ICP和MAP值；B：各组大鼠ICP值；C：各组大鼠ICP/MAP比值*P＜0.05，与假手术组比较；#P＜0.05，与损伤对照组比较；△P＜0.05，与实验A组比较；▲P＜0.05，与实验B组比较Fig.1 Erectile function was assessed at twelve weeks after electrical stimulation of the cavernous nerveA：ICP and MAP in rats of each group value；B：ICP rats in each group：group ICP/C value；C：the ratio of MAP rats *P＜0.05，compared with sham operation group；#P＜0.05，compared with injury control group；△P＜0.05，compared with experimental group A；▲P＜0.05，compared with experimental group B

2.3 CN甲苯胺蓝染色 CN甲苯胺蓝染色对有髓神经轴突进行评估。如图2所示，假手术组有丰富的海绵体神经髓鞘轴突，轴突排列整齐，结构完整，外观形态正常，而损伤对照组轴突排列紊乱，轴突粗细不一，实验A组与损伤对照组相比，轴突数目显著再生，轴突排列、轴突大小均趋向于正常外观。实验A组的CN轴突数目明显高于损伤对照组和其它2个实验组（P＜0.05），但低于假手术组（P＜0.05）。实验B组CN有髓神经轴突数目高于实验C组（P＜0.05）。实验C组和损伤对照组之间CN有髓神经轴突数目无显著差异。

图2 术后第12周各组大鼠CN甲苯胺蓝染色图片（×400）A：假手术组；B：对照组；C：实验A组；D：实验B组；E：实验C组；F：各组大鼠CN有髓神经轴突数目比较*P＜0.05，与假手术组比较；#P＜0.05，与损伤对照组比较；△P＜0.05，与实验A组比较；▲P＜0.05，与实验B组比较Fig.2 Toluidine blue staining pictures of rats CN after 12 weeks（×400）A：sham operation group；B：control group；C：the experimental group A；D：the experimental group B；E：the experimental group C；F：the number ofmyelinated axons of rats CN in each group *P＜0.05，compared with sham operation group；#P＜0.05，compared with control group damage；△P＜0.05，compared with experimental group A；▲P＜0.05，compared with experimental group B

2.4 阴茎背神经NADPH黄递酶染色 阴茎背神经NADPH染色通过NOS阳性神经纤维的数目反映CN的传导功能。如图3所示，假手术组NADPH-黄递酶阳性神经纤维排列均匀，数目较多，而损伤对照组神经纤维排列杂乱，分布不均，粗细不一。实验A组阴茎背神经NADPH-黄递酶阳性神经纤维数目显著高于损伤对照组和其它2个实验组（P＜0.05）。实验B组与实验C组相比，NADPH-黄递酶阳性神经纤维的数目显著增加（P＜0.05）。实验C组和损伤对照组之间NADPH-黄递酶阳性神经纤维的数目差异无统计学意义。

图3 术后第12周各组大鼠阴茎组织NADPH染色图片（×400）A：假手术组；B：对照组；C：实验A组；D：实验B组；E：实验C组；F：各组大鼠阴茎背神经NOS阳性神经纤维数目比较*P＜0.05，与假手术组比较；#P＜0.05，与损伤对照组比较；△P＜0.05，与实验A组比较；▲P＜0.05，与实验B组比较Fig.3 NADPH staining images of rats penile tissue in each group postoperative 12 weeks（×400）A：sham operation group；B：control group；C：experimental group A；D：the experimental group B；E：the experimental group C；F：the rats penile dorsal nerve the number of NOS positive nerve fibers *P＜0.05，compared with sham operation group；#P＜0.05，compared with the control group damage；△P＜0.05，A are compared with the experimental group；▲P＜0.05，and compared to the experimental group B

3 讨论

枸杞子是中医临床上常用的一种传统中药，具有滋补肝肾、益睛明目、润肺、延缓衰老、壮阳等多种功效，在中医男科上应用较多［7-12］。枸杞多糖（LBP）是枸杞子提取液的主要成分，是一种水溶性多糖，由葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、木糖共6种单糖组成，现代科学证明LBP具有保护心肌、保护生殖系统、改善生殖能力、调节血糖、调节血脂、延缓衰老、消除疲劳、抗肿瘤、提高免疫力等作用，且诸多功效与其抗氧化作用有关［13］。本研究通过建立CN双侧钳夹损伤模型，在应用LBP处理后进行了血清MDA含量、SOD活性、GPX活性以及ICP、ICP/MAP、CN甲苯胺蓝染色轴突数目及阴茎背神经NOS阳性神经纤维数目等指标的测定，证实LBP作用一种抗膳食氧化剂，可以通过清除过多的氧自由基，增加抗氧化酶活性，降低CN损伤后的氧化应激作用，促进勃起功能恢复。

Hsieh等［9］报道用止血钳钳夹大鼠双侧CN 2min，大鼠盆腔神经节和CN中NOS阳性神经纤维及ICP值明显降低。我们前期的实验也证实CN钳夹，用显微血管夹钳夹大鼠双侧CN 2 min，大鼠ICP值、CN有髓神经轴突数目中阴茎背神经NOS阳性神经纤维数目明显降低［14-15］。钳夹损伤模型保持了CN鞘膜的完整性，为CN轴突再生提供了一个潜在的通道，这种模型类似于保留神经的前列腺癌根治术（NSRP）所造成的神经损伤，可用于NSRP后神经损伤性ED的CN再生和改善勃起功能的研究。在本研究中，实验A组在第1周和第2周SOD和GPX活性显著高于其它4组，而实验A组的MDA含量在第2周和第4周均明显低于在其它4组。这些结果表明，在前2周应用LBP对CN损伤后引起的氧化应激损伤起着重要的保护作用，而CN损伤4周后LBP的抗氧化功效并不明显。结果显示，在第4周3个实验组SOD和GPX活性没有显著差别；在第12周，5组大鼠之间MDA含量、SOD和GPX活性均没有显著的差异。同时，在本实验研究中，实验A组阴茎背神经NADPH-黄递酶阳性神经纤维数目显著高于损伤对照组和其它2个实验组。这些结果与血清抗氧化水平的变化相一致。本研究为进一步研究LBP促进CN神经再生提供了理论依据。

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（编校：吴茜）

Repairing effect of lycium barbarum polysaccharides on cavernous nerve of rat crush injury model

ZHANG Shu-hong1，CHEN Hua1，WANG Ke-qiang1，ZHANG Yong-hui2，LIU Zi-long3

（1.Department of Pharmacy，Laiwu Maternal and Child Health Hospital，Laiwu 271199，China；2.Department of Medicine，
Laiwu Vocational and Technical College，Laiwu 271199，China；3.Department of Based Medicine，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，China）

ObjectiveTo investigate the effect of lycium barbarum polysaccharides（LBP）on erectile function recovery in a ratmodel of CN crush injury.Methods140 male SD rats were random ly divided into 5 groups：sham operation group，injured control group，and three experimental groups（group A，B，C，were given LBP at1，7，and 14 days respectively for2 weeks after CN crush injury）.Malondialdehyde（MDA），super oxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GPX）were evaluated at 1，2，4，12 weeks.Intracavernous pressure（ICP）and mean arterial pressure（MAP）were assessed at12 weeks.Myelinated axons of CN were evaluated by toluidine blue staining.Nitric Oxide Synthase（NOS）positive nerve fibreswere evaluated by nicotinamide adenine dinucleotide phosphate（NADPH）-diaphorase staining.ResultsSOD and GPX activities in experimental group A were significantly higher than those in other four groups at1 and 2 week（P＜0.05）.MDA levels in experimental group A were significantly lower than those in other four groups at2 and 4 weeks（P＜0.05）.The ICP and ICP/MAP ratio in experimental group A were significantly higher than those in injured control group and other two experimental groups at12 weeks（P＜0.05），but lower than sham operation group（P＜0.05）.ConclusionThe application of LBP in the first2 weeks after CN crush injury promotes nerve regeneration and erectile function recovery via an antioxidativemechanism about reduce the neuron damage induced by oxidative stress.

erectile dysfunction；lyceum barbarum polysaccharide；cavernous nerve；oxidative stress

R698.1

A

1005-1678(2014）07-0014-05

高等学校博士学科点专项科研基金（20090142120054）

张树红，女，学士，主管药师，研究方向：药学，E-mail：zsh13305313973@163.com。