经牵涉区皮下局麻药抑制大鼠子宫炎性痛的实验研究

张铮铮，陆晓媛，张励才

(徐州医学院1.附属医院妇产科、2.江苏省麻醉学重点实验室，江苏徐州 221002)

内脏痛是临床常见的症状之一，特别是中、晚期内脏癌症患者多伴有难以忍受的剧痛，目前仍无确切有效的治疗办法，因此探寻有效治疗途径与方法仍是疼痛研究领域面临的重要课题。

日常体验及新近的研究表明，适当的触摸、按摩、不同频率的Han’s仪以及经皮电刺激(TENS)等可以减轻疼痛［1－3］，这些治疗多以经络或阿是部位为参考。而解剖学研究表明，许多内脏器官及其牵涉区不在经典的经络通路上，既然内脏痛可以导致远离该器官的体表区出现牵涉痛，这说明二者之间必然存在某种内在的形态学联系。可否利用这种内在联系经牵涉皮区施加合适的干预因素抑制内脏痛?迄今尚未见有类似的临床实践与基础研究。我们前期的研究表明，预先在牵涉区皮下注射利多卡因，可以明显减少膀胱伤害性刺激引起的L6～S1脊髓背角Fos阳性细胞的数量［4］，初步提示上述设想可能具有一定的可行性，但不同内脏器官及其牵涉痛是否具有同样的规律仍需进一步深入研究。

子宫痛(包括子宫癌痛)是妇科常见的临床疼痛之一，给无数妇女造成严重的身心痛苦，目前同样缺乏有效的治疗措施，可否经其牵涉区抑制其疼痛，值得探讨。鉴于直接进行人体试验存在伦理学的限制，而人类与动物的牵涉区也因发育的差异不能完全套用，因此如何重新确认动物子宫痛的“牵涉区”是首先需要解决的关键问题。1997年，Wesslmann预先经颈内静脉向循环系统注入伊文思蓝(Evans blue)，然后用芥子油注入大鼠子宫腔制作子宫炎性痛，结果在动物出现子宫炎性痛的同时，其特定体表区(下腹部近耻骨联合处)恒定出现Evans blue渗漏斑［5］。该实验几近模拟了人类牵涉痛现象，客观地显示了动物内脏痛与牵涉区的关系，因此较好地解决了动物无法自述其内脏痛牵涉区的难题。

藉此，本实验拟以Formalin注入子宫制作炎性痛，经其牵涉皮区施加局麻药，以通用的内脏痛评分法［6］作为整体痛行为定量指标，以公认的与痛程度呈正相关的c-fos原癌基因的表达蛋白Fos在相关脊髓节段的表达量作为分子物质的观测指标［8］，探讨经牵涉皮区抑制子宫痛的可行性，以期为临床治疗内脏痛提供新的途径与实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 未孕♀ Sprague-Dawley(SD)大鼠，体质量220～250 g，由徐州医学院实验动物中心提供。动物置于安静、温暖、避强光环境内正常喂养72 h以上。随机分为4组(n=6):A组(单纯子宫炎性痛模型组)，乙醚麻醉下，生理盐水冲洗大鼠阴道，用自制阴道窥器，在目视下将人用硬膜外导管植入子宫腔，深度距阴道外口约4 cm，导入5%Formalin 1.0 ml，留置5 s，不做任何镇痛处理;B组(非牵涉皮区镇痛组)，以A组相同方法制作子宫炎性痛模型后，在远离牵涉区的颈后部皮下注射0.5%的利多卡因0.3 ml作镇痛处理;C组(牵涉皮区局麻药镇痛组)，以B组相同方法制作子宫炎性痛模型后，在牵涉区(耻骨联合上缘)皮下给予0.5%的利多卡因0.3 ml，实施牵涉区局部镇痛;D组(正常对照组)，动物常规饲养，不做任何处理。

1.2 行为学评分 各组大鼠在麻醉苏醒，出现翻正反射1 min后，进行疼痛学评分(S)，评分规则如下:①舔腹部或外阴区为L;②肢体伸展，如伸后肢为B;③躯干扭曲为C;④全身收缩，偶伴痉挛为W，收缩持续时间不足30 s为W1，痉挛在30 s和60 s之间为W2，痉挛多于60 s为W3。计数每15 min内上述4种行为出现的次数，按照公式:S=1L+2B+3C+4W1+5W2+6W3进行疼痛学评分。每15 min为1次，间隔15 min，共3次，持续时间为1.5 h。

1.3 组织制备 各组动物在痛行为学评分观测完毕后，水合氯醛麻醉，经升主动脉先快速灌注150 ml生理盐水，再灌注300 ml 4%多聚甲醛溶液(用0.1 mol·L－1PB配制)，先快后慢，约在2 h内完成。灌注后打开椎板暴露脊髓，取出与支配子宫交感神经相关脊髓节段(T10－L1)。在上述相同灌注液中继续固定(4℃，4～6 h)，5% ～30%的蔗糖磷酸缓冲溶液梯度脱水，直至组织块下沉。将脊髓组织作连续冰冻切片，片厚20 μm，行Fos免疫组化反应。

1.4 Fos免疫组化反应与计数 切片在温室下依次入:(1)兔抗血清(1∶2 000，Cambridge Research Biochemical)，孵育过夜;(2)结合生物素的羊抗兔IgG(Vetor，1 ∶200)孵育2 h;(3)ABC 复合物(Vector，1∶200)孵育1 h。其中，一抗和二抗用含0.3%Triton X-100、0.2%马血清和0.03%NaN3的PBS稀释。最后切片在含0.05%DAB、0.005%硫酸镍铵和0.003%H2O2的Tris-HCI缓冲液(pH 7.6)内呈色20～30 min。将切片裱于涂有明胶的载片上，经干燥、脱水、透明后，DPX封片。显微镜观察、摄像Fos免疫反应阳性神经元。选取Fos表达最集中分布区固定序列切片5张，用Image-Pro Plus Version 6.0 图像分析软件(Media Cybernetics，Bethesda，USA)，统一在放大100倍条件下，进行Fos阳性神经元数目计数。

2 结果

2.1 各组动物的痛行为评分 动物在麻醉苏醒出现翻正反射1 min后，根据Miampamba M法分0～15 min，31～45 min，61～75 min 3个时间段，评分并记录其内脏痛行为表现:子宫炎痛行为主要出现在动物麻醉苏醒出现翻正反射后的前0～15 min时间段内，其中A(子宫痛模型)组和B(非牵涉区镇痛组)内脏痛评分明显增加;C(牵涉区镇痛)组较A，B内脏痛评分降低，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。而在第31～45 min和第61～75 min两个时间段，A、B、C各组内脏痛评分普遍下降，趋缓。组间差异无统计学意义。D(正常对照)组，偶见舔腹部或外阴区(L)行为，未见 B(伸展)、C(扭曲)、W(痉挛)等行为学表现，各时间段差异亦无统计学意义。如Fig 1所示。

2.2 各组动物脊髓相关节段的Fos表达 不予镇痛的模型(A)组计数为192.00±7.62;经非牵涉皮区镇痛(B)组为190.67±7.56;经牵涉皮区镇痛(C)组为54.83±4.45;正常对照(D)组偶见Fos表达，未作计数。C组与A、B组相比，P＜0.01，差异有统计学意义。A、B两组相比，差异无统计学意义。各组动物脊髓相关节段的Fos表达的形态学证据见Fig 2。

Fig 1 Score of visceralgia in every group

3 讨论

以动物子宫痛条件下Evans blue渗漏斑出现部位作为子宫痛的牵涉区仅见Wesslmann报道，其他内脏器官痛是否具有同样的现象尚无先例。我们通过复制或模拟Wesslmann的方法，先后观察了大鼠子宫、膀胱［4］、胆囊［7］、胃［8］等不同内脏器官疼痛的牵涉区，进一步证实以该方法具有普遍的操作性。但应该指出的是，以此法得出的某些内脏器官的牵涉区与既往记载的人类牵涉区部位略有不同，这可能是由于动物与人类胚胎体节生长发育差异所致。

内脏痛的发生机制极其复杂，研究颇多。新近的研究表明，提高雌激素水平可加重内脏痛反应［9］，福尔马林所致的外周炎性痛可诱导脊髓水平的Fos和前强啡肽蛋白表达增加［11］，加巴喷丁对大鼠直肠乙状结肠炎性痛具有镇痛作用［10］。而福尔马林所致的子宫炎性痛可否诱导相关脊髓水平的Fos表达变化?经牵涉区给予局麻药物利多卡因抑制子宫炎性痛尚待证实。本研究基于Wesslmann实验提供的子宫痛牵涉区，观测了经牵涉区给予局麻药利多卡因对子宫炎性痛行为及相关脊髓节段Fos蛋白的影响。结果表明Formalin诱导子宫炎痛行为主要在动物麻醉苏醒出现翻正反射后的前0～15 min时间段内评分明显升高，提示痛反应剧烈。而在第31～45 min和第61～75 min两个时间段，内脏痛评分明显下降，痛反应趋于平缓并减轻。上述结果提示Formalin诱导的子宫(内脏)痛与外周(躯体)痛在行为学反应时相上可能存在异同［12］。即子宫痛的第一时间段(0～15 min)与Formalin诱导的躯体痛的第一时相持续时间与强度近似，而其后的31～75 min时间段的子宫痛程度与Formalin诱导躯体痛的第二时相相比缓解更快，更明显，确切原因尚待进一步探讨。

我们的实验表明，经牵涉皮区给予局麻药物可以明显降低炎性子宫痛的行为学评分，且与之相关脊髓节段的Fos表达量也减少，因此从整体行为与物质分子两个层面提示经牵涉皮区施加合适的镇痛措施有可能缓解内脏痛，为临床内脏痛的治疗提供了新的途径及其实验依据。

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