扇贝糖胺聚糖对六羟基多巴胺诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用

王大超，侯 琳，鞠传霞，张金玉，张 峥，鞠晶慧，刘 赛

(青岛大学医学院1.生化教研室、2、药理学教研室，山东 青岛 266021)

研究报道［1－2］多种海洋多糖可通过抗氧化应激发挥神经保护作用，但海洋贝类多糖神经保护活性的研究则鲜有报道。扇贝糖胺聚糖(Chlamys farreri skirts glycosaminoglycan，CFS-GAG)是本组从海洋贝类栉孔扇贝裙边中提取的活性成分，已获专利(专利号:ZL200410035656.3)。已证实 CFSGAG对血管内皮细胞氧化应激损伤有保护作用［3］，本文研究其对六羟基多巴胺(6-OHDA)诱导SH-SY5Y神经元细胞凋亡的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试剂 CFS-GAG(青岛大学医学院药理室提供);Hoechst 33258、罗丹明123、6-OHDA(Sigma);Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(嘉美生物);反转录试剂盒(Promega);一抗和二抗(Amersham pharmacia biotech)。

1.2 细胞培养、分组 SH-SY5Y细胞株购自中国协和医科大学细胞中心。含10%胎牛血清、1%青、链双抗的DMEM高糖培养基，5%CO2，37℃饱和湿度下培养。分为对照组、模型组(50 μmol·L－16-OHDA 处理24h)、给药组(6-OHDA 处理前，不同浓度CFS-GAG预处理24 h)。

1.3 Hoechst 33258染色 上述方案处理细胞，4%多聚甲醛4℃，固定 30 min，5 mg·L－1Hoechst 33258 避光染色 10 min，荧光显微镜下观察核形态改变。

1.4 Annexin V-FITC/PI双染测凋亡率 0.25% 胰酶消化细胞，10 μl Annexin V-FITC 避光孵育 15 min，加入 5 μl PI，孵育5 min，流式细胞仪检测。

1.5 RT-PCR 测 Bcl-2、Bax mRNA 表达 TRIzol提取RNA，30℃，10 min;42℃，20 min;99℃，5 min;4℃，5 min 反转录。PCR 条件:GAPDH:94℃ 3 min，94℃ 90 s，53℃ 1 min，72℃ 90 s，33 个循环;Bcl-2:94℃ 5 min，94℃ 45 s，64℃45 s，72℃ 2 min，33 个循环;Bax:94℃ 7 min，94℃ 1 min，60℃ 45 s，72℃ 45 s，33 个循环。Bcl-2 引物:上游:5'-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3'，下 游:5'-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3'。Bax引物:上游:5'-CTGACATGTTTTCTGACGGC-3'，下 游:5'-TCAGCCCATCTTCTTCCAGA-3'。GAPDH 引 物:上 游:5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游:5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。2% 琼脂糖凝胶电泳，光密度扫描分析。

1.6 Western blot测Bcl-2、Bax蛋白表达 细胞裂解液提取总蛋白，蛋白变性，SDS-PAGE电泳，转膜和封闭。与一抗(兔抗人Bcl-2抗体，1∶300;兔抗人 Bax抗体，1∶300)和过氧化物酶标记二抗(羊抗兔抗体，1∶500)作用。化学发光剂反应，X线片曝光，显影、定影。图像分析系统扫描和分析。1.7 流式细胞仪测线粒体膜电位变化 收集细胞，10 mg·L－1罗丹明123，37℃避光孵育15 min，流式细胞仪测荧光强度。

2 结果

2.1 细胞核形态学变化 6-OHDA处理后，观察到典型凋亡形态学改变:核破碎、染色质聚集，伴DNA碎片，而对照组细胞核呈均匀蓝色荧光。400、800 mg·L－1CFS-GAG可抑制凋亡形态学改变。

2.2 CFS-GAG对凋亡率影响 6-OHDA处理后，凋亡率升高，400、800 mg·L－1CFS-GAG 能降低凋亡率(Tab 1)。

Tab 1 Effect of CFS-GAG on apoptotic rate and mitochondrial membrane potential(±s，n=3)

Tab 1 Effect of CFS-GAG on apoptotic rate and mitochondrial membrane potential(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs 6-OHDA;$P＜0.05，$$P＜0.01 vs 200 mg·L －1CFS-GAG;＆＆P ＜0.01 vs 400 mg·L －1CFS-GAG

Group Dose/mg·L －1 Apoptotic rate/% Mitochondrial membrane potential/%of control Control 29.73 ±3.8 100.00 ±2.86 6-OHDA 59.86 ±7.83＊＊ 61.23 ±2.03＊＊CFS-GAG 200 56.09 ±5.1 54.78 ±6.36 400 42.06 ±5.24##$ 70.94 ±2.20##800 29.08 ±3.58##$$＆＆ 69.36 ±2.68##

2.3 CFS-GAG对线粒体膜电位影响 6-OHDA处理后，线粒体膜电位低于对照组，400、800 mg·L－1CFS-GAG能抑制线粒体膜电位的降低(Tab 1)。

2.4 CFS-GAG对Bcl-2、Bax mRNA和蛋白表达影响 6-OHDA处理后，Bcl-2 mRNA和蛋白表达下降，Bax mRNA和蛋白表达升高，Bcl-2/Bax比值降低。400、800 mg·L－1CFSGAG预处理后，Bcl-2 mRNA和蛋白表达增加，Bcl-2/Bax比值升高(Tab 2)。

3 讨论

6-OHDA作用SH-SY5Y细胞后，出现明显凋亡形态改变，且凋亡率升高，而400、800 mg·L－1CFS-GAG能抑制6-OHDA诱导的凋亡。

Bcl-2抑制细胞凋亡，Bax促进凋亡。Bcl-2/Bax比值降低，可诱导凋亡［4］。Tab 2结果显示，6-OHDA损伤后，Bcl-2/Bax比值降低，400、800 mg·L－1CFS-GAG 预处理后，Bcl-2/Bax mRNA比值升高。

Bcl-2/Bax比值变化，可引起线粒体膜电位的改变。抑制线粒体膜电位下降，可阻抑细胞凋亡［5］。400、800 mg·L－1CFS-GAG能明显抑制线粒体膜电位的降低，维持线粒体稳定。

综上所述，CFS-GAG可能是通过升高Bcl-2/Bax比值，抑制线粒体膜电位下降，抑制6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。

Tab 2Effect of CFS-GAG on Bcl-2 and Bax mRNA and protein expression(±s，n=3)

Tab 2Effect of CFS-GAG on Bcl-2 and Bax mRNA and protein expression(±s，n=3)

＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs 6-OHDA;$$P ＜0.01 vs 200 mg·L－1CFS-GAG;＆P ＜0.05，＆＆P ＜0.01 vs 400 mg·L－1CFSGAG

Group Dose/mg·L－1 mRNA Protein 3 100.00 ±1.73 100.00 ±2.69 100.00 ±1.54 6-OHDA 32.76 ±2.03＊＊ 123.52 ±3.45＊＊ 26.52 ±1.75＊＊ 42.52 ±1.83＊＊ 208.67 ±2.09＊＊ 20.38 ±1.16＊＊CFS-GAG 200 39.11 ±3.30 117.81 ±2.22 33.22 ±3.83 47.38 ±2.91 207.82 ±2.22 22.80 ±1.85 400 72.94 ±2.32##$$ 116.53 ±2.81 62.59 ±1.74##$$ 67.33 ±1.71##$$ 206.53 ±2.81 32.61 ±1.41##$$800 80.42 ±2.98##$$＆ 115.67 ±3.00 69.50 ±1.62##$$＆＆ 76.47 ±2.04##$$＆＆ 205.67 ±3.00 37.20 ±1.66 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax Control 100.00 ±1.34 100.00 ±2.06 100.00 ±1.6 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax##$$＆＆

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