椭圆叶花锚总黄酮对脂肪性肝炎模型大鼠的药理作用研究

顾秀琰， 朱建坤 ， 张 琳

(1. 甘肃省中医院药学部，甘肃 兰州730050;2. 甘肃中医学院教学实验中心，甘肃 兰州730000)

氧自由基关系到多种疾病的发生与发展，许多疾病的病理变化与过量自由基的产生有关联。在肝炎病变过程中，氧自由基是参与其间的一类物质，在不同程度和阶段的病理过程中可有不同程度和范围的作用。椭圆叶花锚作为治疗肝胆疾病的传统民族植物药［1］，对其黄酮类成分抗氧自由基作用的研究，是了解该植物的一项必要途径。

1 材料与方法

1.1 药物与仪器 椭圆叶花锚全草(采自甘肃省甘南藏族自治州，地域海拔3 500 米左右)，由甘肃省中医院闵云山主任药师和甘南林业技术服务中心杜平研究员共同鉴定。大鼠IgG ELISA、白蛋白ELISA、ALT ELISA 检测试剂盒(美国USCN 公司);大鼠SOD ELISA、丙二醛ELISA 试剂盒(日本株式会社同仁化学研究所);恒温水浴箱、分光光度计、移液枪(广州聚能生物科技有限公司)。乙醇为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 实验动物 SD 大鼠80 只，SPF 级，体质量(200 ±20)g (甘肃中医学院实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK ［甘］2011-0001)。

1.3 椭圆叶花锚黄酮提取流程 椭圆叶花锚全草→干燥→粉碎→过60 目筛→称定质量→75%乙醇浸提→浸提液减压浓缩成浸膏→干燥→粉碎。

1.4 动物模型(脂肪性肝炎)制备 取正常喂养1 周后的大鼠80 只，随机分为空白对照组、模型对照组、高剂量组、低剂量组，每组20 只，均给以普通饲料，自由饮水。其中，模型组大鼠附加高能量合剂，用合剂加蒸馏水配制成质量浓度为1 g/mL 的混浊液，按1 g 高能合剂/100 g 大鼠体质量的量，每天灌胃1 次，连续30 d。结果，观察到大鼠行动迟缓、毛色晦暗、肝脏有不同程度的肿大或右肋下触痛敏感、进食量减少等体貌特征，而且肝脏组织HE染色发现，肝小叶结构完整，少许细胞出现脂肪变性，汇管区有炎症细胞浸润，部分肝细胞坏死，说明造模成功［2］(高能量合剂的组成为猪油15 g、植物油15 g、胆固醇7.5 g、蔗糖15 g、胆盐1 g、奶粉8 g、复合维生素0.5 g、吐温8.5 mL、丙二醇5 mL，加蒸馏水至100 mL［3］)。

1.5 给药方法 造模成功后7 d 开始给药，其中高、低剂量组是给药组，分别以5、1 g/kg 的量加入椭圆叶花锚黄酮(加入方法为称定每组大鼠的总体质量，分别以5、1 g/kg的比例称取椭圆叶花锚黄酮，混入粉碎的饲料中，压制烘干)，连续给药15 d，给药结束后按造模前正常的饲养方法进行饲养。

1.6 实验动物处理 给药结束，正常饲养7 d 后，麻醉大鼠，股动脉采血(不加抗凝剂)约5 mL。然后，断颈处死大鼠，剖腹摘取肝脏，置于4%福尔马林溶液中固定。

1.7 标本处理

1.7.1 肝脏切片 取固定好的肝脏组织，放入脱水机中进行脱水(95%乙醇阶段加上E 染色操作)，再通过透明、透蜡、包埋、切片、贴片、烘干、脱蜡、复水以及H 染色后，得到肝脏组织细胞染色切片。然后，通过显微镜观察、对比、分析肝脏组织学变化。

1.7.2 血清检测 利用酶联免疫法分别对SOD、MDA、血清白蛋白(ALB)以及ALT 这四种生化物质进行定量检测，将采得的血液置于试管中，待其凝固后，分离血清。然后，准备酶联反应孔板，设定空白孔、标准孔以及加标孔，分别加样，按照温育→配液→洗涤→加酶→温育→洗涤→显色→终止的步骤，应用SOD 试剂得到测定液。在待测样品终止15 min 内进行测定，以空白孔调零，450 nm 波长下依次测量各孔的吸光度，分别得到SOD 和MDA 的OD值。由于光度值直接反映了生化物质含有量的变化，因此本实验直接用它进行结果比较与分析，不进行含有量值的转换。

1.8 数据分析 利用SPSS 12.0 统计软件进行分析，结果以±s 表示，实验结果采用方差分析，组间差异的两两比较采用q 检验。

2 结果

2.1 椭圆叶花锚黄酮对脂肪性肝炎模型大鼠肝细胞的影响在肝脏切片病检时观察到，模型对照组大多(15 个切片，占75%)肝细胞肿大，胞浆疏松，呈网状半透明，具备胞浆疏松化特征，汇管区有少量炎性细胞的浸润，胞浆内多见脂滴性空泡，提示肝细胞脂肪性变化特征。另外，低剂量治疗组病理切片观察结果与模型对照组细胞的组织特点接近，见图1;高剂量治疗组大多(14 个切片，占70%)干细胞分布均匀，胞浆疏松化肝细胞较少，胆管与汇管区受压程度减轻，炎症细胞少见或没有，见图2。

图1 模型对照组肝脏切片(20 ×40)

图2 高剂量药物组肝脏切片(20 ×20)

2.2 椭圆叶花锚黄酮对SD 大鼠血清ALB 和ALT 水平的影响 与空白组比较，模型组ALB 水平降低，ALT 水平升高，提示模型大鼠肝细胞受损，血清蛋白合成减少，细胞受损后转氨酶释入血液的量显著增加(P ＜0.05);与模型组比较，各剂量组ALB 水平升高，ALT 水平降低，提示肝细胞受损程度明显缓解(P ＜0.05)。另外，低、高剂量组间ALB 和ALT 水平的差异不显著(P ＞0.05)，但反映出含有量变化趋势，高剂量黄酮与低剂量相比，在保护肝细胞方面呈现出一定范围内的正比例关系，见表1。

表1 椭圆叶花锚黄酮对SD 大鼠血清ALB 和ALT 水平的影响(±s)

表1 椭圆叶花锚黄酮对SD 大鼠血清ALB 和ALT 水平的影响(±s)

注:与模型组比较，* P ＜0.05;与空白组比较，△P ＜0.01

组别 例数ALB/(mg·L -1)ALT/(U·L -1)20 370.6 ±23.5 215.2 ±21.4模型组 20 180.4 ±16.3 615.2 ±34.2△椭圆叶花锚黄酮低剂量组 20 278.4 ±41.2 490.4 ±12.6*椭圆叶花锚黄酮高剂量组空白组20 321.1 ±14.5 410.3 ±32.2

2.3 椭圆叶花锚黄酮对SD 大鼠血清SOD 与MDA 水平的影响 与空白组比较，模型组SOD 水平减少、MDA 水平升高，表明在肝病过程中，过氧化反应加速，肝细胞处于受损的变化状态，清除氧自由基的酶系能力显著降低(P ＜0.05);与模型组比较，剂量组SOD 水平明显升高(P ＜0.05)，但低、高剂量组间SOD 水平的差异不显著(P ＞0.05);与模型组比较，低剂量组MDA 水平降低，但两组间差异不显著(P ＞0.05)，而低、高剂量组间MDA 水平的差异显著(P ＜0.05)，见表2。

表2 椭圆叶花锚黄酮对SD 大鼠血清SOD 与MDA 水平的影响(±s)

表2 椭圆叶花锚黄酮对SD 大鼠血清SOD 与MDA 水平的影响(±s)

注:与模型组比较，* P ＜0.05;与空白组比较，△P ＜0.01

组别 动物数SOD/(U·g -1)MDA/(mol·g -1)20 252.82 ±32.42 174.71 ±31.11模型组 20 128.13 ±30.35 403.10 ±33.76△椭圆叶花锚黄酮低剂量组 20 290.85 ±43.26 350.56 ±67.49*椭圆叶花锚黄酮高剂量组空白组20 312.23 ±29.12 210.79 ±53.13

3 讨论

肝炎发病机制复杂，导致肝细胞损害和坏死，病理过程中免疫系统的参与是主要的病理环节。有研究证实，在肝病变过程中，肝脏局部会聚集大量的Treg 细胞，是外周Treg 细胞对病变组织的趋化［4］，表明在肝病过程中免疫机制是增强的。此外还有非免疫因素，如微循环障碍、内毒素(ETM)和氨基酸失衡等，氧自由基(OFR)与病毒性肝炎关系之研究正日益引起重视并逐步深入［5］。OFR 对组织的损害，除了对肝细胞直接毒性外，它还参与免疫功能紊乱、肝微循环障碍、内毒素血症、钙稳定失衡等一系列病毒性肝炎的病理生理过程，在整个病理过程中都可能对肝细胞造成损害。氧自由基过多对机体的危害表现在使许多生物分子，如核酸、蛋白、膜多聚不饱和脂肪酸(PUFA)等产生过氧化反应，生物大分子出现交链或断裂，引起细胞结构功能的破坏。PUFA 的过氧化将直接影响膜结构，使膜孔隙扩大、通透性增加;细胞内质网膜、线粒体膜、溶酶体膜等生物膜系统的液体镶嵌模式发生改变，导致细胞广泛损害。另外，自由基和过氧化脂质(LPO)在肝炎的肝细胞损害中也起到了重要作用。

SOD 能催化·O-产生歧化反应，是体内·O-的天然清除酶，在清除自由基和抑制脂质过氧化过程中起着主要作用［6］。肝炎患者抗氧化酶系统中的一些分子可能受到损害，从而使清除自由基的能力降低，增加的氧自由基通过破坏生物大分子，导致了肝细胞抗原结构的改变以及肝组织细胞结构的损害，促进了免疫反应及炎症的发展，炎症的发展使自由基的产生进一步增加，血清LPO 水平升高，而自由基增加又可加重肝细胞的病变，从而形成恶性循环［7］。对抗氧自由基是药物治疗肝炎机制中的一个可能环节［8］，通过药物影响氧自由基变化的实验，可以证明椭圆叶花锚治疗肝炎的可能途径之一是抗氧自由基路径。另一方面，黄酮是广泛分布的一类物质，生物类黄酮能够有效清除体内的自由基，具有消炎、抗菌、抗病毒、保肝、护肝等作用，黄酮类物质抗氧自由基作用是确定的。该类化合物的结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团，此外，它还常与糖结合成苷，黄酮苷一般易溶于水，而如白藜芦醇等化合物的水溶性很低，故必须与相关蛋白结合后才能在血清中保持较高的浓度［9］。花锚全草含有三萜类、黄酮类、酮类等近20 种化学成分，其中水溶性成分花锚苷和去甲氧基花锚苷为抗肝炎的主要有效成分［10］。椭圆叶花锚中含有齐墩果酸，已有大量研究证实，它具有清热、消炎、抑菌、保肝、护肝、增加白细胞、降低转氨酶等作用［11］。而且，黄酮苷元类成分是药效物质基础之一［12］，其中呫吨酮苷对CCl4所引起的实验性肝损伤有促进恢复的作用，能促进肝细胞再生，增加肝细胞内糖元与核糖核酸［13］。花锚的酮单体成分和提取部位均具有保肝、免疫调节、抗氧化、抗病原微生物等作用［14］。MDA是氧自由基使细胞膜中的PUFA 发生过氧化反应的终产物，通过测定血清中MDA 水平，可间接反应氧自由基的活性，与SOD 共同作为反映人体自由基代谢的一对指标，两者呈负相关关系，也可作为肝细胞损伤程度的指标，与病情活动或疾病进程相关［15］。中药清除超氧自由基、过氧化氢、羟自由基等产物，使得SOD、和CAT 活性增加，也减少了氧自由基对组织和细胞的攻击，使MDA 水平下降［16］。

基于以上认识，我们开展了对椭圆叶花锚黄酮药理作用的实验研究，在测定血清SOD 和酯质过氧化产物MDA水平变化的同时，对大鼠肝脏进行了病理切片观察，从选用实验指标在实验中的变化关系上，验证椭圆叶花锚治疗肝炎的可能途径。从理论上讲，SOD 广泛存在于机体，其活力的体现一方面是其水平高低差异直接的影响，而另一方面，是在一定水平上不同强度(水平)的作用力，这与机体一定阶段的生化状态条件有关，由于其广泛存在，故是主要的机制，也能体现中医药作用的本质在于改善机体生化状态而不单纯是物质在量上的累加。目前涉及SOD 的药物是其自身制剂，而提高其水平的大多是中医药研究，或者是与本实验相关度不高的药物。所以，实验中没有设立药物对照组，而是通过自身对照来证明药物实际药理效应。

本实验发现，椭圆叶花锚总黄酮能降低实验模型大鼠血清MDA 水平，同时提高SOD 水平，表明黄酮类成分在治疗肝病的过程中，对抗氧自由基酶系统(SOD 是其中主要的一种酶)起到了辅助增强的作用，判断依据是SOD 水平的升高与MDA 水平的下降。肝脏病理检查提示，椭圆叶花锚总黄酮可以改善肝细胞受损的状态，这种作用应该归结于对酶类分子合成与衰减的调节，调节分子代谢的途径可以归类于基因靶位的作用，但具体的分子机制在本实验中无法得到明确的认识。

另外，本实验只是在总黄酮和血清物质含有量测定的水平上进行，是对药物进行研究的初步实验层次，而对药物透彻的把握，需要深入到分子层面，从具体分子调控的位点与途径去分析药物的作用机理。而且，对药物还应该进一步提纯，越是纯化的药物成分，越能反映药理作用的可靠性。调控细胞因子产生和作用的关键点便能控制氧自由基损伤肝细胞的病理过程，通过调节内源性细胞因子产生、应用细胞因子增强或抑制分子应答，可能成为治疗肝病的一个途径。今后，对椭圆叶花锚的研究应该以此为标准，纯化药物成分并确定实验分子水平的理论路径，开展进一步深入的研究。

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