高压氧预防大鼠早期激素性股骨头坏死实验研究*

赵振广，潘树义，李 航

（1.中国人民解放军医学院，北京 100853；2.中国人民解放军海军总医院高压氧医学中心，北京 100048）

高压氧预防大鼠早期激素性股骨头坏死实验研究*

赵振广1，2，潘树义1，2，李 航2

（1.中国人民解放军医学院，北京 100853；2.中国人民解放军海军总医院高压氧医学中心，北京 100048）

目的观察高压氧对动物激素性股骨头坏死的预防作用。方法 将35只雄性Wistar大鼠随机分为空白组5只，造模组15只，预防组15只。造模组给予地塞米松磷酸钠注射液腹腔注射10 mL/kg，2次/周，制备激素性股骨头坏死模型；对照组在造模处理基础上同时给予高压氧，压力为1.8 ATA（绝对大气压），每日1次，每次1 h；空白组予以等量生理盐水注射。实验第8周，对所有大鼠行双髋正位X线摄片检查，随后处死动物并取大鼠双侧股骨头，分别行大体和光镜观察。结果 3组大鼠股骨头双髋正位X线摄片及股骨头标本大体外观均未发现异常，在病理切片上可发现显著差异。切片HE染色后光镜观察显示空白组无骨坏死灶，造模组出现明显的骨坏死灶；与造模组比较，预防组骨细胞受损程度较轻。结论 高压氧对激素性股骨头坏死的早期骨细胞坏死有一定的防护作用。

高压氧；大鼠；股骨头坏死；激素

随着糖皮质激素在临床的广泛应用，激素性股骨头缺血性坏死（steroid induced avasular necrosis of femoral head，SANFH）的发病率呈逐年上升趋势。SANFH患者以中青年男性为主，若未得到及时正规治疗，绝大多数患者将于确诊后3年内出现严重功能障碍甚至股骨头塌陷，全髋关节置换手术是晚期SANFH的唯一出路。因此，早期即对SANFH患者采取综合治疗措施，从而有效阻止和限制股骨头坏死的进一步发展，具有重大的临床意义[1]。已有研究表明，高压氧可增加血管成纤维细胞、成骨细胞、软骨母细胞活性，促进骨新陈代谢，加速骨组织修复。因此从理论上讲，高压氧疗法（hyperbaric oxygen therapy，HBOT）是激素性股骨头坏死一种有效的治疗方法。国内研究发现，66.7%的SANFH患者在应用HBOT后，有效阻止了病情的发展[2]，国外学者报道其有效率甚至达81%[3-4]。笔者在上述系列研究的基础上，重点探索了早期高压氧介入对SANFH的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器

健康雄性4月龄Wistar大鼠35只，体重为（0.21±0.01）kg，由军事医学科学院提供，动物合格证编号为SCXK-(军)2012-004；所有大鼠分为7笼，饲养于海军总医院实验动物中心，自由饮水进食，饲养条件一致，颗粒饲料由海军总医院实验动物中心提供。地塞米松磷酸钠注射液（成都天台山制药有限公司，国药准字H20052125，规格为每支2 mg）；水合氯醛溶液（青岛宇龙海藻有限公司，国药准字H37022673）；多聚甲醛及10%EDTA脱钙液（自配）。AXIOMAristos MX型西门子X线摄影成像系统（西门子公司）；RM2235型徕卡石蜡切片机、德国LEICA DM500型三目生物显微镜及图像信号采集与分析系统（德国Leica公司）。

1.2 方法

动物模型制作及分组：动物适应性喂养1周后，精确称重并编号，依据随机数字表法完全随机分为3组，即空白组5只，造模组15只，预防组15只。经 t检验，3组动物在体重方面差异无统计学意义。动物模型的制作采用地塞米松造模法[5]：造模组给予地塞米松磷酸钠注射液10 mL/kg腹腔注射，2次/周，持续8周，制备激素性股骨头坏死模型。预防组则在上述造模处理基础上同时给予高压氧，高压氧开始时间为第1次地塞米松磷酸钠注射液腹腔注射的次日，治疗压力为1.8绝对大气压(ATA)，每日1次，每次1 h，持续8周；空白组予以等量生理盐水注射。

X线摄片检查：于距首次注射8周末，全部动物水合氯醛麻醉，拍双髋正位X线片。

大体观察：主要观察动物体重变化、步态、毛色以及动物股骨头大体形态。

病理组织学检查：采用放血处死法，取双侧股骨头，将所取标本置多聚甲醛溶液中固定3 d，然后置10%EDTA缓冲液中脱钙，每周更换脱钙液1次，持续2个月。脱钙完全后取材，脱水，制作蜡块，切片行HE染色。光学显微镜下观察骨小梁、骨髓组织、成骨细胞及骨细胞的变化。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 X线摄片检查

3组动物行髋关节正位X线检查均无异常发现。根据国际骨循环研究会(ARCO)分期，提示为正常或者0期、Ⅰ期改变。

图1 髋关节X线检查结果

2.2 大体观察

3组动物均无明显步态变化，造模组及预防组可见明显消瘦，毛发杂乱，缺少光泽；股骨头外观均晶莹光滑，肉眼观察无差异。体重差异见表1。

表1 3组大鼠喂养8周后体重比较

2.3 病理组织学观察

选取股骨头软骨下区域观察，可见空白组骨小梁完整，排列规则，致密饱满，骨髓组织含量丰富，骨细胞清晰可见，核较大，大多位于中央，空骨陷窝罕见；造模组标本均出现骨小梁稀疏、变细、甚至断裂或被疏松结缔组织包绕分解成云片状，结构紊乱，骨髓组织含量稀少，成骨细胞稀少，骨细胞核固缩、边聚或消失形成空骨陷窝；预防组标本亦出现股骨头坏死征象，骨小梁亦有稀疏，变细，与造模组比较，骨髓组织含量更丰富，成骨细胞及正常形态骨细胞数目明显增多，空骨陷窝少见。见图2。进一步在高倍镜下任意取50个视野，计数骨细胞数量和空骨陷窝，并计算空骨陷窝率以反映股骨头坏死程度，见表2。

表2 3组大鼠股骨头切片正常形态骨细胞数量、空骨陷窝率比较

3 讨论

在实验及临床研究中，预防性应用抗凝、调脂、抗骨质疏松药、活血化瘀类中药已被证实可有效预防SANFH的发生。李卫哲等[6]的研究证实，大剂量应用激素同时应用蚓激酶对预防激素所致股骨头坏死有一定作用；Norman等[7]使用依诺肝素对大鼠骨坏死模型进行治疗，证实低分子肝素可阻止骨坏死发生；Pritchett[8]报道了284例患者接受大量激素治疗的同时，坚持预防性服用洛伐他汀直到激素治疗结束，最终仅3例患者(占1%)发生股骨头坏死，远小于3% ～20%的激素所致股骨头坏死的发生率；Lai等[9]通过应用阿仑膦酸盐进行预防，与对照组进行临床比较，表明阿仑膦酸盐能有效阻止 SteinbergⅡ或Ⅲ期的非创伤性股骨头坏死的早期塌陷；史风雷等[10]的研究表明，复方丹参注射液对SANFH有一定预防作用。

2005年，我院率先将高压氧用于严重急性呼吸综合征(SARS)患者SANFH的临床研究[11]，通过分析51例临床资料发现，经高压氧治疗100次后进行核磁共振(MRI)复查，26例呈现不同程度的改善，且对早期SANFH改善尤为明显。另一现临床研究则提示，对20例中晚期SANFH患者进行高压氧治疗后，患者MRI影像未见进行性骨质缺失，病情未继续加重[12-13]，认为高压氧治疗对SANFH患者明确有效，且治疗中干预起始时间可能与疗效相关。为此，本研究拟将HBOT提前，将HBOT作为一种预防措施同时与激素使用，选定8周作为时间节点来判定预防效果。由病理切片可明显看到，8周后造模组大鼠股骨头组织显示骨坏死改变，而预防组正常形态骨细胞数量更多，空骨陷窝率更低，其骨细胞坏死程度明显轻于造模组。HBOT对全身各组织的缺血性病变有其独特的疗效，吸入高分压氧可使体内动脉血氧分压得到明显提高，血氧弥散半径明显增大，从而使氧分子更易渗透到低氧或缺氧的病变组织细胞，促进新陈代谢[14]，活跃破骨细胞及成骨细胞，使早期骨坏死或处于临界状态的骨质逐渐被吸收，新骨形成加快[15]，最终修复股骨头。

综上所述，高压氧对于SANFH的早期骨细胞坏死有一定的防护作用，推测高压氧加快股骨头的修复可能是其发挥预防作用的机制之一。本研究中高压氧选用的方案较保守，具体为压力1.8 ATA，每日1次，每次1 h。或许存在一种更优的高压氧方案，或将高压氧与调脂、抗凝、中药联用从而完全避免股骨头坏死发生，有待进一步研究。

[1]黄 俊.股骨头缺血坏死的治疗[J].实用全科医学，2007，5(7)：642-643.

[2]杨妍想，张月敏，崔晓霞.高压氧治疗股骨头无菌坏死的疗效观察[J].中国实用医药，2010，5(15)：104-105.

[3]Reis ND，Schwartz O，Militianu D，et al.Hyperbaric oxygen therapy as a treatment for stage-I avascular necrosis of the femoral head[J].J Bone Joint Surg Br，2003，85(3)：371-375.

[4]Peskin B，Shupak A，Levin D，et al.Effects of non-weight bearing and hyperbaric oxygen therapy in vascular deprivation-induced osteonecrosis of the rat femoral head[J].Undersea Hyperb Med，2001，28(4)：187-194.

[5]Yang L，Boyd K，Kaste SC，et al.A mouse model for glucocorticoidinduced osteonecrosis：effect of a steroid holiday[J].J Orthop Res，2009，27(2)：169-175.

[6]李卫哲，李景南，张 新.抗凝药物预防激素所致股骨头坏死[J].吉林大学学报：医学版，2003，29(4)：475-476.

[7]Norman D，Miller Y，Sabo E，et al.The effects of enoxaparin on the reparative processes in experimental osteonecrosis of the femoral head of the rat[J].APMIS，2002，110(3)：221-228.

[8]Pritchett JW.Statin therapy decreases the risk of osteonecrosis in patients receiving steroids[J].Clin Orthop Relat Res，2001(386)：173-178.

[9]Lai KA，Shen WJ，Yang CY，et al.The use of alendronate to prevent early collapse of the femoral head in patients with nontraumatic osteonecrosis.A randomized clinical study[J].J Bone Joint Surg Am，2005，87(10)：2 155-2 159.

[10]史风雷，任丽霞，孙升云，等.复方丹参注射液预防激素性股骨头坏死的初步研究[J].中医正骨，2002，14(4)：195-197.

[11]潘晓雯，张 禹，潘树义，等.高压氧治疗SARS后股骨头坏死六例[J].中华航海医学与高气压医学杂志，2004，11(2)：105-106.

[12]潘树义，潘晓雯，张 禹，等.高压氧治疗SARS后股骨头坏死51例[J].中华航海医学与高气压医学杂志，2005，12(3)：159-161.

[13]郭 勇，潘树义，林 伟，等.SARS患者康复期早期骨缺血坏死的MRI征象[J].中国医学影像技术，2004，20(12)：1 911-1 914.

[14]易 伟，薛德麟.高压氧在神经外科疾病治疗中的机理和应用[J].中国康复，2003，18(6)：379-380.

[15]印卫锋，郭风劲，陈安民.高压氧治疗胸腰椎骨折合并脊髓损伤[J].中国康复，2004，19(5)：292-293.

Hyperbaric Oxygenation(HBO)on Preventing the Steroid-Induced Avascular Necrosis of the Rats

Zhao Zhenguang1,2,Pan Shuyi1,2,Li Hang2
(1.301 Hospital of PLA,Beijing,China 100853; 2.Navy General Hospital of PLA,Beijing,China 100048)

Objective To investigate the effects of hyperbaric oxygenation (HBO)on preventing the steroid-induced avascular necrosis of the femoral head (SANFH)of mammals.Methods Distributing the 35 male Wistar rats into 3 groups：5 rats for blank group, 15 rats for model group,and 15 rats for control group.The rats in the model group and the control group were injected the dexamethasone sodium phosphate injection(10 mL/kg,2 times/week)in the abdominal cavity to built the model of SANFH.While establishing the rats model,the rats in the control group were given the HBO (pressure：1.8ATA,1 time/day,1 hour/time)at the same time.And the blank group were injected normal saline.After 8 weeks,anteroposterior bilateral hip X-Ray examinations were performed in all of the rats.Then,executed them,took the femoral head out and the general observation and histological study were performed.Results There was no obvious abnormality in the results of the general observation and the X-Ray examinations.But there were visible differences between model group and control group in the pathological sections.After stained with HE,the sections were observed under the light microscope：there were no focal osteonecrosis in the sections of the blank group and obvious focal osteonecrosis in the model group.And comparing with the model group,the osteocytes in the control group had a lighter damage.Conclusion HBO can prevent the damage of osteocytes during earlier period of SANFH.

hyperbaric oxygenation;rat;femoral head necrosis;glucocorticoid

R459.9；R332

A

1006-4931(2015)19-0025-03

赵振广，硕士研究生，主治医师，主要从事临床高压氧科治疗工作，（电子邮箱）xiaoyu-free＠126.com；潘树义，博士研究生，主任医师，研究方向为高压氧对疾病的防治，本文通讯作者，（电子邮箱）psy9992011＠163.com。

2015-02-05)

*北京市自然基金资助项目，项目编号：7154241；全军医学科技青年培育项目，项目编号：13qnp075。