大鼠深静脉血栓形成模型建立及观察

吴鹏 黄晨 冯惠岗 庄炜钊 唐郁宽 谢贞静 郭惠庄 郭冬梅 时光 陈汉威

·基础研究·

大鼠深静脉血栓形成模型建立及观察

吴鹏 黄晨 冯惠岗 庄炜钊 唐郁宽 谢贞静 郭惠庄 郭冬梅 时光 陈汉威

目的 建立大鼠深静脉血栓形成（DVT）模型，观察实验大鼠术前及术后不同时间凝血酶原时间、纤维蛋白原含量、D-二聚体含量及血栓长度的变化情况。方法 将30只SD大鼠用结扎阻断下腔静脉及其分支，并用微血管夹钳夹损伤静脉壁的方法诱导深静脉血栓形成。于术前第1天及术后第1、4、7、10、14、21天采静脉血检测纤维蛋白原含量、D-二聚体含量及凝血酶原时间，并行血管造影观察血栓及血管再通情况。结果 共23只大鼠深静脉血栓模型制作成功，功率76.67%（23/30）。纤维蛋白原含量、凝血酶原时间及D-二聚体含量在术前与术后之间的差异有统计学意义，但术后不同时间之间差异无统计学意义；术后血栓长度在不同时间的差异均有统计学意义。结论 凝血酶原时间、纤维蛋白原及D-二聚体可作为是否有血栓形成的重要参考指标，但在评价病情进展及严重程度方面价值有限；血栓长度随时间先增长，后又溶解，直至消失。

大鼠； 模型，动物； 纤维蛋白原； D-二聚体

静脉血栓栓塞症包括深静脉血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）和肺动脉栓塞（pulmonary thromboembolism，PTE），每年的发病率在1‰以上，是患病率及死亡率的重要原因[1]。1875年Cohnleim和Litten首次采用动物实验证实DVT可导致肺动脉栓塞，奠定了通过动物实验模型研究DVT或PTE病理生理机制的基础[2]。深静脉血栓形成的复杂机制目前尚未充分明确，故制备出与人类深静脉血栓形成相似的动物模型很困难，犬、猪等大动物的深静脉交粗大，但在阻断血流过程中，有一定的死亡率，且费用昂贵，重复性难[3-4]。目前最常用的实验动物是大鼠和小鼠，我们用SD大鼠建立深静脉血栓形成模型，对DVT的病理变化进行观察研究。

材料与方法

一、对象

选用清洁级SD大鼠，体重在200～250 g，由暨南大学动物实验中学提供并饲养，饲养环境：SPF级，温度（23±20）℃，每天给予标准颗粒饲料及水，自由摄食，每天定时清洁。

二、建立大鼠DVT模型

步骤：①术前禁食12 h，用0.3%戊巴比妥行腹腔注射麻醉（单位剂量0.15 ml/100 g），麻醉后取仰卧位，备皮、消毒、铺巾。②取下腹部正中线作纵行切开，长3～4 cm，显露腹腔，将部分肠管移出腹腔，用蘸有生理盐水的湿纱布保护小肠。充分显露后腹膜，腹主动脉紧贴在下腔静脉（inferior vein cava，IVC），腹主动脉呈鲜红色，IVC颜色较深，呈暗红色。③钝性分离IVC表面的腹后膜及结缔组织，于左肾静脉起始处往下分离IVC和腹主动脉。在IVC表面并行放置1条4号丝线，用5-0 Prolene缝合线同时一起结扎，并在结扎线下方上微血管夹，再缓慢抽出4号丝线，1 h后移开血管夹。④下腔静脉处理完后，检查腹腔有无出血，将肠管回纳入腹腔，逐层关腹，再次进行切口消毒。术后用暖灯保暖至大鼠清醒。

三、标本采集及观察

1.血液标本采集：在术前及术后第1、4、7、10、14、21天，进行眼眶静脉丛采血。具体步骤：①对大鼠进行麻醉后，左手拇、示两指从背部较紧地握住大鼠的颈部，注意防止大鼠窒息。②当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物颈部两侧，使眶后静脉丛充血。右手持长颈（3～4 cm）硬质玻璃滴管（毛细管内径0.5～1.0 mm），使采血器与鼠面成45°角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再旋转180°使斜面对着眼眶后界。刺入深度4～5 mm。当感到有阻力时即停止推进，同时将针退出少许，血液能自然流入毛细管中，滴入采血器，每次采血约2 ml，立即移除毛细管。③将采集到的血液标本1 h内送检，在转速3500转/分下离心15 min，采用凝固法检测标本中纤维蛋白原含量及凝血酶原时间，D-二聚体（D-dimer，DD）含量采用免疫比浊法检测，所需试剂均由Siemens公司提供，使用Sysmex公司全自动凝血分析仪CS-5100进行检测。

2.下腔静脉造影：采完血液标本后，对大鼠进行下腔静脉造影。具体步骤：①用2 ml注射器（去针头）抽吸1 ml生理盐水，连接24G一次性静脉留置针，大鼠尾部左右两条静脉相对比较容易穿刺，以大鼠尾巴下三分之一的位置适宜，用75%的乙醇棉球擦拭穿刺部位，使穿刺部位血管充盈及消毒。②进针时左手食指和拇指固定大鼠的尾巴，让大鼠的尾巴经过拇指后向下弯曲，进针点靠近拇指前端。针头和血管成30°角，针尖斜面朝上，轻轻挑刺入皮肤后针头立即和血管平行，可将针头刺入血管多半，轻轻回抽针栓，看见有明显的回血，正常情况下，推注的过程应该没有明显阻力，血管也不会鼓起。③确定穿刺进入尾静脉，将针栓完全拔出，用胶布将针头固定在大鼠尾巴上，将大鼠取仰卧位，四肢及尾巴固定在硬纸板上，在DSA机（GE INOVA3100）下进行造影，留置针连接装有对比剂（碘克沙醇320 g/L）的注射器，在X线照射下手推注射器，分别取正、侧位进行造影。观察、测量并记录下腔静通畅情况、侧支循环及血栓长度。

四、统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件分析，DD、纤维蛋白原含量、凝血时间、血栓长度以±s表示，不同时间段之间的比较采用方差分析和SNK检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、总体情况

23只大鼠存活，死亡7只（非解剖死亡），其中有4只大鼠在建模过程中，损伤大血管，出血死亡，另3只在实验过程中因采血或过度麻醉死亡，最终总体制作成功率76.67%（23/30）；存活的23只经DSA造影均可见血栓形成。

二、统计分析结果

1.描述性统计分析：凝血酶原时间均数值术后较术前减少，在第14、21天逐渐恢复至术前水平；纤维蛋白原及DD含量术后较术前有升高，在第14、21天亦逐渐恢复至术前水平；血栓长度变化表现出一定的时间规律，先增长，在第7天左右达到最长，后又减少，在第14天时明显缩短，到第21天基本消失（见表1）。

2.方差分析：结果显示各观察指标的差异均具有统计学意义（P＜0.05）。经不同时间段各观察指标间两两比较的SNK检验，按α=0.05水准：①可认为术前凝血酶原时间值高于术后各时间段的均值，但尚不能认为术后各时间段凝血酶原时间的均数不同；②血栓长度在术后第7天最大，依次为术后第4天、术后第10天，术后第1天及第14天的差异无统计学意义，最后为第21天；③术后第1、4、7、10天DD含量高于术前及术后第14、21天的，但术后第1、4、7、10天DD含量差异无统计学意义，尚不能认为术前及术后第14、21天DD含量不同；④术后第1天纤维蛋白原的含量达到最高，其次为术后第4、7、10、14天，最后是术后第21天及术前第1天，术后第1、4、7、10天纤维蛋白原的均数差异无统计学意义，术后第4、7、10、14天纤维蛋白原均数的差异无统计学意义，术后第21天及术前第1天的差异亦无统计学意义。

表1 各观察指标在不同时间段的值（±s）

表1 各观察指标在不同时间段的值（±s）

观察指标 凝血酶原时间（s）纤维蛋白原含量（g/L）DD含量（μg/L）血栓长度（mm）术前第1天 11.15±1.27 1.44±0.25 30.00±11.34 —术后第1天 9.67±1.13 2.18±0.33 55.33±14.08 11.51±2.97术后第4天 9.69±0.76 2.08±0.36 58.00±18.59 21.54±3.44术后第7天 9.19±0.96 2.10±0.46 50.67±13.35 24.56±2.03术后第10天 9.95±1.28 2.02±0.50 55.33±15.06 14.88±3.45术后第14天 10.17±1.02 1.78±0.24 40.00±16.04 10.65±4.18术后第21天 10.27±1.05 1.50±0.22 29.33±11.00 1.27±0.71总体 10.01±1.20 1.87±0.44 45.52±18.08 12.06±9.06

表2 各观察指标方差分析表

讨 论

本实验在制作大鼠深静脉血栓模型时，对大鼠造成较大的创伤，且结扎下腔静脉造成血液流通不畅及损伤血管壁，机体很快启动凝血机制，结扎约1 h后就能肉眼观察到血栓形成。凝血酶原时间、纤维蛋白原及DD在大鼠深静脉血栓制作前后均有明显变化，但术后其各自变化规律与相应时间段血栓长度的变化规律都不符，甚至每只大鼠的凝血酶原时间、纤维蛋白原及DD含量变化规律都不尽相同。可得出结论：凝血酶原时间、纤维蛋白原及DD含量的变化是判断血栓形成的重要观察指标，但在评估血管栓塞病变范围及程度特异性不高。近年来随着医学研究的进展，越来越多的疾病被证明与纤维蛋白原和DD相关，肺栓塞、静脉血栓、弥散性血管内凝血障碍、感染、肿瘤及骨折等是均其升高的病因，导致纤维蛋白原和D-二聚体对于DVT的诊断特异性不高。有循证医学证据显示DD定量检测结合患者的临床表现对于排除DVT具有较高的敏感性[5]。

纤维蛋白原一直以来被作为预测血栓和血栓形成的独立危险因素。许多流行病学研究已证实，高纤维蛋白原水平与心血管事件的发生有明显相关性[6]。纤维蛋白原是血浆中含量最高的凝血因子，在血液凝固和血小板聚集中均具有重要作用。纤维蛋白原在体内转变为纤维蛋白和不溶性降解产物，这些物质对血管平滑肌有刺激作用，可使血管平滑肌由动脉中层转移至内膜，并在内膜增殖，从而启动了血栓形成的过程；纤维蛋白原作为血液组成成分，其分子大且有聚合作用，是除红细胞外决定血液黏度的第二重要因素。血浆纤维蛋白原水平增高，可以改变血液黏度和血液流变学指标，尤其是血浆黏度，而血液流变学指标和血浆黏度的改变又与内皮细胞损伤和血栓形成等多种效应有关[7]。

DD是已交联纤维蛋白降解产物中含有γ键的片段，它的生成或增高反映了凝血和纤溶系统的激活，其血浆中的水平可代表体内凝血酶的活性及纤维蛋白的生成情况，可作为体内血栓形成的指标之一[8]。DD含量可以定性地反映血栓形成后的溶栓效果，即定量检测血浆D-二聚体水平可以间接明确溶栓治疗的效果，对于诊断、筛选新产生的血栓和掌握停止DVT溶栓治疗的时机具有重要的临床指导意义[9]。

纤维蛋白原和DD是血液发生血栓及血栓前状态的凝血及纤溶系统活性改变的分子标志物，可反映体内凝血和纤溶过程的变化，是血栓形成或溶解的标志[10]。定期监测两者水平可以动态地反应机体的高凝状态程度，对于选择临床治疗方案和患者溶栓治疗的预后评估有重要意义。

本实验所用的下腔静脉血栓模型是最为常用、简便的大鼠血栓模型，与人体的深静脉血栓形成状况存在较大差别。人体深静脉血栓形成是一个全身性、系统性的复杂病变，形成的血栓基本很难自溶，且并发症较多，而本实验用的大鼠深静脉血栓模型在术后第21天已基本完全自溶，其中机制有待进一步研究。

1 Huang W, Goldberg RJ, Anderson FA, et al. Secular trends in occurrence of acute venous thromboembolism: Worcester VTE Study（1985-2009）[J]. Am J Med, 2014，127(3):829-839.

2 Dalen JE. Pulmonary embolism：what have we learned since Virchow？ Natural history, pathophysiology, and diagnosis[J]. Chest,2002,122（4）:1440-1456.

3 Sood V, Luke C, Miller E, et al. Vein wall remodeling after deep vein thrombosis：differential effects of low molecular weight heparin and doxycycline[J]. Ann Vasc Surg, 2010,24（2）:233-241.

4 Dewyer NA, Sood V, Lynch EM, et al. Plasmin inhibition increases MMP-9 activity and decreases vein wall stiffness during venous thrombosis resolution[J]. J Surg Res, 2007,142（2）:233-241.

5 熊立凡，王鸿利.D-二聚体与静脉血栓症诊断-循证实验诊断举例[J].诊断学理论与实践，2005,1（4）：75-78.

6 Danesh J, Collins R, Appleby P, et al. Association of fibrinogen, C-reactive protein，aibumin, or leukocyte count with coronary heart disease：meta-analyses of prospective studies[J]. JAMA，1998，279（18）：1477-1482.

7 熊长明.D-二聚体在深静脉血栓形成和急性肺栓塞中的诊断价值[J].中国医药导刊，2002，4（2）：104-105.

8 胡云建，陶凤荣，王厚东，等.D-二聚体测定在肺栓塞诊断中的应用价值[J].中华检验医学杂志，2002，25（2）：95-97.

9 Joffe HV, Goldhaber SZ. Upper-extremity deep vein thrombosis[J]. Circulation，2006，106（14）：1874-1878.

10 Naito M. Effects of fbrinogen，fbrin and their degradation products on the behaviour of vascular smooth muscle cells[J]. Nippon Ronen Lgakkai Lasshi，2007,37（6）：458-463.

Establishment and observational studies of deep venous thrombosis in rats model

Chen Hanwei, Email: docterwei@sina.com

Objective To establish deep venous thrombosis (DVT) model in rats, and analyze the changes of prothrombin time, fbrinogen content, D-dimer content and thrombus length before and after operation. Methods All of 30 SD rats were ligatured and blocked the inferior vena cava and its branches, and injured vein wall by micro vessel clamp method to induce the formation of deep venous thrombosis. Venous blood were collected to detected the fbrinogen content, D-dimer content, and prothrombin time at 1 day before operation and postoperative 1, 4, 7, 10, 14, 21 days. The angiography performed to observe the thrombosis and blood vessel recanalization. Results A total of 23 deep venous thrombosis models were successfully produced, with a power of 76.67% (23/30). Prothrombin time, fbrinogen content and D-dimer content in the preoperative and postoperative were statistically signifcant, but the differences were not statistically signifcant between different time after operation. There were signifcant differences in the length of thrombus in different time. Conclusions Prothrombin time, fbrinogen content and D-dimer content can be used as important reference indexes in the formation of thrombosis, but in the evaluation of disease progression and severity of the value were limited. The thrombus length increased with time, then dissolved, and disappeared.

Rats； Model, animal； Fibrinogen； D-dimer

2014-7-4）

（本文编辑：黄强）

10.3877/cma.j.issn.2095-5782.2015.02.009

511400 广州市番禺中心医院介入治疗科

陈汉威，Email：docterwei@sina.com

Wu Peng*, Huang Chen,Feng Huigang, Zhuang Weizhao, Tang Yukuan, Xie Zhenjing, Guo Huizhuang, Guo Dongmei, Shi Guang, Chen Hanwei. *The First Clinical College of Jinan Univrsity, Guangzhou 510600, China

吴鹏，黄晨，冯惠岗，等.大鼠深静脉血栓形成模型建立及观察[J/CD].中华介入放射学:电子杂志,2015, 3(2): 91-94.