药品质控实验室用水的微生物分析

顾珉　杨美琴　马仕洪　顾炳仁

（1苏州市食品药品检验所，江苏苏州215002；2中国食品药品检定研究院，北京100050）

药品质控实验室用水的微生物分析

顾珉1杨美琴2马仕洪2顾炳仁1

（1苏州市食品药品检验所，江苏苏州215002；2中国食品药品检定研究院，北京100050）

目的：针对目前国内药检所微生物实验室用水的实际情况，探索实验室用水微生物分析的可行方法，提出合理的水微生物污染的质控水平。方法：参考国内外药典对药用水的微生物质控方法，采用培养基方法考察了实验用水在储水期、培养基配制过程中的微生物生长情况和运用96孔酶标板法初步考察了水的污染程度对培养基检测性能的影响。结果：水在储水期、培养基配制过程中的微生物生长迅速，在水的微生物污染程度达到104cfu/mL的时候对培养基的检测性能有影响。结论：本研究为微生物实验室水质影响评估和合理利用实验室用水提供了依据。

实验室用水；微生物分析；培养基法；96孔酶标板法

制药用水由于其在制药工业中的重要地位，世界卫生组织和各国药典不断制定和修改新的水质标准；《中国药典》2010年版二部（附录XVI）制药用水共收载了饮用水、纯化水、注射用水及灭菌注射用水等4种制药用水［1-4］。而在微生物实验室中，水在培养基和消毒液配置、实验器皿清洗、样品稀释和处理等方面发挥着重要的作用。随着微生物检测技术不断发展，人们对实验用水带来实验风险的认识不断深化和提高，根据国内药检所微生物实验室的实际使用情况，在微生物实验过程中涉及到的实验室用水主要包括蒸馏水、纯化水、超纯水、水浴、自来水等。这其中涉及的大部分水样不在药典质量控制的范围以内，对于微生物实验室，缺乏可行的实验用水质量控制依据。

目前，药品微生物实验室日常配制培养基和试剂以及清洗玻璃器皿主要以蒸馏水为主。本研究考察了蒸馏水在储存期间微生物载荷的变化和在培养基配制过程中的微生物载荷的测定，并对不同污染程度的蒸馏水配制的培养基性能进行了评估。本研究提出的对实验用水微生物监控的目标是通过对实验室各个环节中使用水的微生物计数和代表性微生物的鉴定来评估实验中所用水的质量情况。根据实验室用水的实际应用情况，提出合适的微生物控制水平，即作为一种预警及纠正水平的指标，采取必要的措施如清洗、消毒或及时更换新的水样来降低微生物污染水平，以符合微生物实验室生物污染风险控制的需要。

1　实验仪器、材料

1.1考察水样

中国食品药品检定研究院培养基室制备蒸馏水、微生物实验室自来水、微生物实验室中水浴。

1.2培养基

胰酪胨大豆琼脂培养基（以下简称TSA，批号：120607，北京三药科技）；营养琼脂培养基（以下简称NA，批号：120420，北京三药科技）；玫瑰红钠琼脂培养基（以下简称RA，批号：120509，北京三药科技）；Difco R2A琼脂培养基（批号：211320，BD公司）；胰蛋白胨大豆肉汤培养基（以下简称TSB，批号：8203190，BD公司）；4.5 mL ID鉴定管（BD公司）。

1.3仪器

2　实验方法与结果

2.1培养基配置用水微生物考察

取清洗干净的储水桶5个，分别标记为桶1～5，1次加满蒸馏水后，连续5日对储水桶中的水取样。将每份水样TSA培养基置35℃培养72 h，R2A培养基置25℃培养5天，每个水样稀释级别平行测定2个平皿，进行菌落计数，以2个平皿计数的平均值记录结果。

2.2不同水质配制培养基灭菌前微生物生长情况考察

表1　储水桶中微生物数变化趋势（cfu/mL）

取灭菌蒸馏水和不同微生物污染级别的蒸馏水样（水样1～4），分别按配方制备NA培养基、RA培养基、TSA培养基、R2A培养基，充分溶解分散均匀后，模拟培养基灭菌前等待状态置30℃孵育2 h，取上述培养基溶液稀释至适当浓度后精密吸取100 μL，立即涂布至预制TSA平板，35℃培养72 h，见表2。

表2　不同微生物污染级别蒸馏水配制培养基液灭菌前涂布计数（cfu/mL）

2.3不同水质配制培养基检测性能比较

取灭菌蒸馏水和不同储水期的水样（水样5～8）分别配制TSB培养基（表3），按培养基配制水样分成5组，充分溶解混匀后，置30℃培养箱孵育2 h，立即灭菌（121℃，15 min）。灭菌后的5组培养基分别选择大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌4株标准菌株作为TSB培养基指示能力的参考物。取上述4种菌悬液，分别用上述5组TSB培养基在96孔酶标板上进行10倍梯度稀释，共稀释11个级别，每个菌液在每种培养基中平行制备两组，最后一列8个微孔加空白培养基液作为空白背景。将加样后96孔酶标板置35℃培养24 h后置MSS酶标仪检测，测定波长为492 nm，得到最终试验结果见表4（表中数字表示最后显示阳性结果的稀释级）。

表3　配置培养基蒸馏水样微生物计数（cfu/mL）

2.4水样中主要微生物分析

按无菌操作将取水样100 μL涂布在血琼脂平板上，35℃培养48～72 h后，取典型特征的单个菌落划线分离至新鲜的灭菌平板，35℃培养18～24 h后，取分离的单个菌落适量革兰染色，显微镜下观察细菌特征。另取分离的单菌落用BD公司的ID肉汤配制成0.5～0.6麦氏浊度的菌悬液，按细菌显微镜观察结果将制备的菌悬液加至对应的微生物鉴定卡中，用phoenix-100全自动生化鉴定仪进行菌种鉴定，鉴定结果见表5。

乱世中大批士人选择了南迁至南唐、西蜀等地，〔2〕(卷二六二，P9075) 其中的名士有罗隐 （五代初至吴越）、李元（后梁时避居湖南）等。隐逸为士人在世道污浊时保持人格的独立提供了可能，是士人温和地反抗现实的方式，是一种“不求兼济，但求独善”的逃避行为，所谓“明主既难谒，青山何不归”正是这类人心境的写照，隐士们走的是精神上的自我放逐之路。

表4　不同微生物污染程度蒸馏水配置TSB培养基检测性能比较

表5　水样中分离出微生物

2.5实验结果

在制药用水微生物计数方法中，存在着“高营养”和“低营养”两种计数培养基体系分别进行计数。美国药典建议在水系统验证期间，高低营养培养方式可同时进行［2］。本研究选择了TSA培养基和R2A培养基分别代表高低营养培养基对水的污染程度进行评价。由表1数据可知，随着储水期限的延长，其中的微生物数有逐日增加的趋势，在第5日大部分水桶的微生物指标接近了104cfu/mL的级别，保存至两周甚至达到了106cfu/mL的污染级别；R2A培养基的计数结果普遍高于TSA培养基，在水污染程度较低的情况下，结果的差异比较明显，然而R2A培养基上的菌落形态普遍较为细小，从外观上无法区分不同种的细菌，不易于进行后续分析；在微生物污染程度较高的情况下，TSA的计数值接近R2A的计数值，且TSA平板上菌落生长较为典型，易于挑取进行后续染色、观察和鉴定。因此，两种培养基的选择应基于水微生物污染检验的目的，根据实验室自身水系统的特点选择合适的培养基。

培养基配制结束后微生物增殖迅速，在灭菌前2 h有2～10倍的增长（表2），配制用水的初始微生物污染载荷是造成培养基中的微生物载荷大量增加的主要因素，因此，实验室需要关注水的原始污染对微生物试验结果造成的影响。本研究提出使用酶标仪检测培养基的阳性反应，TSB是一种基础富营养液体培养基，对不同种类的菌株均有较好的增殖作用，因此被选择作为测试的参照培养基。利用酶标仪的高灵敏度和高检测通量实现不同微生物载荷水配制的培养基灵敏度的比较，通过测定发现水样中微生物数达到104cfu/mL级别时，会对灭菌后培养基的检出性能产生一定影响（表4），水样6，7和8配制的TSB培养基灵敏度与无菌水、水样5配制的TSB培养基在测试的4个试验菌组均有显著差异，检测灵敏度低于微生物载荷数量低的水配制的培养基。

从对蒸馏水的微生物分离物鉴定分析来看（表5），制备出的蒸馏水与自来水主要微生物关联度不大，有一些如人葡萄球菌、表皮葡萄球菌等主要来自人源污染的微生物，需要加强对本实验室制水工作人员操作的规范性，鉴定结果可为实验室制水系统污染调查提供依据。

3　讨论

3.1关于实验方法

目前，常用培养基法对水的微生物计数。经典的用于水微生物实验的培养基法包括浇灌平板法、涂布平板法、薄膜过滤法和最大可能计数试验法（MPN法）等［2］。本文选择了涂布平板法对储水期的用水进行微生物计数，相比浇灌平板法，涂布法具有实验迅速、需氧菌生长良好和易于观察菌落特征等优点，因而选择用涂布法考察了不同水质配制培养基灭菌前微生物生长情况。

对于培养基的质量控制主要是通过比较对标准菌株的灵敏度差异，由于固体培养基计数过程冗长，实验中受人员操作影响因素较多，而96孔酶标板法具有所需样品微量化、检验通量大、仪器检测快速灵敏等特点［5］，本文提出利用96孔酶标板梯度稀释标准菌株菌悬液，通过培养结束后培养基指示能力的差异比较培养基的检测性能。

3.2培养基的选择

由于微生物实验室中配制培养基的蒸馏水或纯化水洁净程度相对较高，其中存在的微生物可能处于低营养状态，在培养的初期观察不到细菌或只能观察到菌落形态较小的菌，随着培养时间的延长，菌落逐渐清晰可见。在通常情况下，兼性的低营养细菌可以在高营养培养基上生长，一些兼性的富营养细菌可以在低营养培养基上生长，但这个重叠部分是不完全重合的［2］。在本研究中，同时选择了高营养的TSA培养基和低营养培的R2A培养基对水中的微生物进行检测，兼顾缓慢生长的细菌和在低营养情况下最适生长的细菌。在本研究中，低营养和高营养培养方式同时使用，以更好地评估实验室用水的微生物污染状况和清洁措施效率。

3.3实验室用水风险评估

在微生物实验室中，检验工作的核心问题是培养基的检测性能。影响培养基质量的除培养基本身的配方质量、培养基保存的条件、灭菌条件等因素以外，配制用水的微生物污染程度也是需要着重关注的因素。因此，要加强实验用水的日常监控和根据水的微生物污染发展状况确定制水系统和储水装置的消毒、清洗的周期和频率。

在微生物实验室中，还涉及到一些辅助或特殊用途的水，主要包括自来水、超纯水和水浴等。自来水主要用于玻璃器皿的粗洗和实验室外围的清洁工作，同时也是实验室制备纯化水和蒸馏水的主要水源。通过日常对实验室自来水的微生物检测，自来水监测到的微生物数量在30～500 cfu/mL之间，这主要与水厂的日常净水工艺有关。同时注意到，自来水中的微生物相比蒸馏水中微生物的恢复时间更长，通常需要48 h以上才能观察到有菌落生长，甚至延长培养至5天才观察到完整的生长情况。水浴在培养基保温和某些实验样品处理等用途中会有应用，可以适时对水浴中的水样监测和增加换水的频次，以减少使用不当为微生物实验室环境和样品带来污染的风险。

对于一个具有良好规范的微生物实验室而言，有必要加强对实验室各个环节用水的微生物污染状况的监控。根据实验室的实际条件，适时地提出实验室用水污染的预警和纠正标准，为微生物实验室科学合理用水提供依据。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：411.

［2］美国药典委员会.美国药典［S］.35版.华盛顿：美国药典委员会.2012：886.

［3］欧洲药典委员会.欧洲药典［S］.7版.斯特拉斯堡：欧洲药品质量管理局，2011，2：2319.

［4］卫生部.药品生产质量管理规范（2010年修订）［S］.卫生部令第79号，2011-01-17.

［5］王秀华，雷质文，黄杨冰.96孔酶标板法测定对虾血淋巴的过氧化物酶相对活性的初步研究［J］.海洋科学，2001，25（11）：55-57.

Microbiological Analysis of Water Used in Laboratory of Quality Control of Pharmaceuticals

Gu Min1，Yang Meiqin2，Ma Shihong2，Gu Bingren1
（1 Suzhou Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215002，China；2 National Institute for Drug and Food Control，Beijing 100050）

Objective:In view of the actual situation of the water used in microbiological laboratories in domestic institutes for drug control，feasible methods for microbiological analysis of water for laboratory use were explored and the reasonable standards were put forward for the quality control of water at different microbial contamination levels.Methods:Referring to the methods set forth in domestic and foreign pharmacopoeias for quality control of microorganism in the water for pharmaceutical use，an investigation was conducted，using culture medium method，of the microbial growth in water for laboratory use during the period of water storage and the process of culture medium preparation，and the impact on the detection performance of culture medium by water microbial contamination was detected using 96-well enzyme labeling plate method.Results:During the water storage period and the process of culture medium preparation，microbial growth was fast and the detection performance of culture medium was impacted when microbial contamination level of water reached to 104cfu/mL. Conclusion:A basis was provided for the assessment of water quality and the reasonable utilization of water for the microbiological laboratories.

Water for Laboratory Use；Microbiological Analysis；Culture Medium Method；96-well Enzyme Labeling Plate Method

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.10.004

2015-06-11）

顾珉，男，硕士，主管药师。研究方向：药品微生物检验、微生物鉴定和分型技术研究。E-mail：scofei@aliyun.com

顾炳仁：男，主任药师，硕士生导师。研究方向：抗生素药物分析、微生物检验和鉴定研究。通讯作者E-mail：2803307338@qq.com