RP-H PLC同时测定万古霉素和茶碱的血清药物浓度

唐喆　管静

（南京市妇幼保健院药剂科，江苏南京210004）

RP-H PLC同时测定万古霉素和茶碱的血清药物浓度

唐喆管静

（南京市妇幼保健院药剂科，江苏南京210004）

目的：应用反相高效液相色谱法（RP-HPLC），建立同时测定人血清中万古霉素和茶碱浓度的分析方法，为临床监测万古霉素和茶碱血药浓度提供实验手段。方法：采用外标法，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液（V/V，19∶81，pH=3.2），流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，236，280 nm双波长检测。结果：万古霉素在2.5～100.0 μg/mL浓度范围内线性良好（r=0.999 6），茶碱在2.5～50.0 μg/mL浓度范围内线性良好（r=0.999 9）；万古霉素高、中、低浓度的提取回收率为87.28%～102.24%，方法回收率为100.89%～105.24%，日内精密度为0.95%～3.48%，日间精密度为3.59%～4.20%；茶碱高、中、低浓度的提取回收率为99.55%～103.46%，方法回收率98.28%～99.76%，日内精密度为0.95%～4.28%，日间精密度为1.58%～3.80%。结论：该方法灵敏度高，选择性强，快速、简便、准确，适用于临床标本的检测和药物代谢动力学研究。

反相高效液相色谱法；万古霉素；茶碱；血药浓度监测

万古霉素是一种糖肽类抗生素，临床上主要用于对抗革兰阳性菌特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）所致的感染性疾病。万古霉素具有耳毒性、肾毒性等不良反应，临床应用时需进行血药浓度监测，以降低相关不良反应发生风险［1-2］。茶碱是临床常用平喘药，治疗指数窄，个体差异大，血药浓度过高可引起呼吸、心跳停止等严重不良反应。接受茶碱治疗的患者均应测定血药浓度［3-4］。万古霉素与茶碱在临床上时常联合用药，抢救危重患者［5］。目前尚未有同时监测万古霉素与茶碱血药浓度方法的报道。本文采用RP-HPLC法，意在建立同时监测万古霉素与茶碱血药浓度的方法，以满足临床需要。

1　仪器与试剂

1.1仪器

日本岛津高效液相色谱仪（LC-20AT泵，SPD-15C紫外检测器，DGU-A3在线脱气机，SIL-10AF自动进样器），色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），电子天平（Mettler XS205），高速冷冻离心机（Thermo Sorvall ST 16R），pH计（Mettler DElTA320）。

1.2试药

万古霉素标准品（批号：130360-201302，纯度90%），茶碱标准品（批号：100121-201104，纯度99.5%），购于江苏省食品药品检定研究院。甲醇和乙腈均为色谱纯（美国天地TEDIA），磷酸二氢钾和高氯酸均为分析纯（南京化学试剂有限公司）。

2　方法

2.1溶液的配制

精密称取万古霉素标准品10 mg于10 mL容量瓶中，精密称取茶碱标准品10 mg于20 mL容量瓶中，分别加入超纯水稀释至刻度，摇匀，分别得万古霉素与茶碱的储备液，4℃避光保存。将万古霉素储备液稀释成浓度为12.5，25.0，50.0， 125.0，250.0，500.0 μg/mL的万古霉素系列标准溶液备用，将茶碱储备液稀释成浓度为12.5，25.0，50.0，100.0，125.0，250.0 μg/mL的茶碱系列标准溶液备用，均4℃避光保存。

精密称取磷酸二氢钾6.8 g，加超纯水溶解至1 000 mL，用磷酸调节pH至3.2，0.45 μm微孔滤膜滤过，超声脱气后备用。

2.2色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流动相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液（V/V，19∶81，pH=3.2），流速：1.0 mL/min，检测波长：236，280 nm（在波长236 nm条件下检测万古霉素，在波长280 nm条件下检测茶碱），柱温：30℃，进样量：20 μL。

2.3样品预处理

取血清样品600 μL于2 mL EP管中，加入800 μL沉淀剂（甲醇-乙腈-6%高氯酸=1∶1∶6，V/V/V）沉淀蛋白，涡旋混匀1 min，13 500 r/min离心10 min，取上清经0.45 μm针头过滤器滤过后，转入样品瓶中待测。

3　结果

3.1方法专属性

在上述的色谱条件下，万古霉素与茶碱分离完全，血中内源性物质对测定无干扰（图1），两者的保留时间分别为10.703 min和14.021 min。

3.2线性范围和检测限

分别取“2.1”项下万古霉素标准溶液与茶碱标准溶液各200 μL，加入空白血清600 μL，配制成含万古霉素2.5～100.0 μg/mL、茶碱2.5～50.0 μg/mL的系列标准浓度血清样本，按“2.3”项下方法进行预处理，按“2.2”项下色谱条件进行测定。分别以样品峰面积（Y）对浓度（C）进行线性回归。万古霉素的标准曲线为：

Y=9 606.8C-6 962.4，

图1　万古霉素与茶碱的HPLC色谱图

r=0.999 6（n=5）；

茶碱的标准曲线为：

Y=27 719C-988.52，

r=0.999 9（n=5）。结果显示，万古霉素在2.5～100 μg/mL浓度范围内线性关系良好，茶碱在2.5～50 μg/mL浓度范围内线性关系良好。万古霉素最低定量限为2.5 μg/mL，最低检测限为1.0 μg/mL。茶碱最低定量限为1.0 μg/mL，最低检测限为0.5 μg/mL。

3.3回收率与精密度

取人空白血清，分别加入万古霉素和茶碱标准溶液，配成万古霉素浓度为2.5，25.0，100.0 μg/mL和茶碱浓度为2.5，20.0，50.0 μg/mL的标准浓度血样各5份，按“2.3”项进行前处理后测定，连续测定5天。所测得药物峰面积代入回归方程计算测得量，以计算测得量与加入量之比即方法回收率；所测得药物峰面积除以同一浓度的标准溶液所得峰面积，以计算提取回收率。结果见表1。由表1可见，万古霉素和茶碱的回收率和精密度符合生物样本的测定要求［6］。

3.4稳定性考察

3.4.14℃条件下稳定性考察分别取“2.1”项下万古霉素标准溶液与茶碱标准溶液各200 μL，加入空白血清600 μL，配制成含万古霉素25.0 μg/mL、茶碱20.0 μg/mL的标准浓度血清样本5份。于4℃冰箱内分别放置0，1，3，5天和1周后按“2.3”项下操作，注入色谱仪，记录峰面积。计算此条件下万古霉素与茶碱峰面积RSD值，分别为4.86%与5.25%。由此可知，血清样品在4℃条件下保存一周内可保持稳定。

表1　血清中万古霉素与茶碱的回收率和精密度

3.4.2冻融稳定性考察配制成含万古霉素25.0 μg/mL、茶碱20.0 μg/mL的标准浓度血清样本5份。于-20℃冰箱内分别冻存0，1，2，3周和1月，溶解样品后按“2.3”项下操作，注入色谱仪，记录峰面积。计算此条件下万古霉素与茶碱峰面积RSD值，分别为7.03%与6.86%。表明血清样品在-20℃条件下冻存后可保持稳定。

4　结论与讨论

血药浓度监测试验中，一般常用的样本预处理方法有蛋白沉淀法、液液萃取法、固相萃取法等［7-10］。有文献报道，用高浓度硫酸锌溶液沉淀血清中的蛋白，离心后进样［11］。但经试验发现，经硫酸锌溶液沉淀蛋白后的上清液仍有浑浊，经0.45 μm针头过滤器过滤时，会堵塞过滤器，无法进样测定。也有文献报道，以三氯醋酸溶液作为血清蛋白沉淀剂［12-13］。试验结果表明，以三氯醋酸溶液作血清样本前处理时，血清中内源性物质与药物色谱峰不能完全分离，干扰最终结果的测定。本研究以混合溶剂（甲醇-乙腈-6%高氯酸=1∶1∶6，V/V/V）作为蛋白沉淀剂，可以完全沉淀血清中蛋白，并保证样品回收率。

文献报道监测万古霉素血药浓度一般选用磷酸二氢钾缓冲液和甲醇或乙腈作为流动相［8，12］，监测茶碱血药浓度一般选用甲醇和水或缓冲盐溶液作为流动相［14-15］。试验中发现，有机相比例对药物色谱峰保留时间影响很大；缓冲液种类与pH值的选择决定了药物是否能顺利地从色谱柱中洗脱。经反复配比试验，最终选择甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液（V/V，19∶81，pH=3.2）作为流动相。这一色谱条件可以很好分离万古霉素与茶碱，且血清内源性物质对两者的测定不产生干扰。

《中国药典》2010年版第二部中，万古霉素和茶碱的检测波长分别为280 nm和271 nm［16］。由于血清样品中药品浓度很低，万古霉素在280 nm检测波长下吸收度偏低，该检测波长不能满足试验需要（图1D）。参考大量报道可知，万古霉素在波长236 nm下有较好的紫外吸收［8，12］。茶碱在波长236 nm下有一定紫外吸收，但空白血清样品在波长236 nm下与保留时间14 min处有一较小杂峰，该杂峰与茶碱的保留时间接近，干扰茶碱峰面积的计算（图1A），故考虑采用双波长法排除干扰。参考《中国药典》2010年版中茶碱的检测波长，在271 nm附近反复调整后发现，波长280 nm下茶碱保留时间附近无内源性杂峰干扰，且茶碱峰强度较好。因此采用双波长检测法，在236 nm波长下检测万古霉素，在280 nm波长下检测茶碱，既保证了待测药物的吸收度，又排除了内源性物质的干扰。

综上，本法能够同时测定万古霉素与茶碱的血药浓度，且血清取样少，检验快速稳定，操作简便，成本较低，适用于临床监测。

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Simultaneous Determination of Plasma Concentrations of Vancomycin and Theophylline by RP-HPLC

Tang Zhe，Guan Jing（Department of Pharmacy of Maternity and Child Health Care Hospital of Nanjing City，Jiangsu Nanjing 210004，China）

Objective:To establish an analytical method for the simultaneous determination of concentrations of vancomycin and theophylline in human serum by reversed phase high-performance liquid chromatography（RP-HPLC）so as to provide an experimental means for clinical monitoring of plasma concentrations of vancomycin and theophylline.Methods:External standard method was applied and Agilent ZORBAX SB-C18column（4.6 mm×250 mm，5 μm）was used.The mobile phase consisted of methanol-0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate buffer solution（V/V，19∶81，pH=3.2），at a flow rate of 1.0 mL/min，the column was at 30℃and the dual detection wavelength was at 236 and 280 nm.Results:A good linearity ofthe concentration of vancomycin was obtained within a range of 2.5～100.0 μg/mL（r=0.999 6）and within a range of 2.5～50.0 μg/mL（r=0.999 9）for theophylline.The extraction recovery rates of vancomycin in high，medium and low concentrations were 87.28%～102.24%，the objective recovery rates were 100.89%～105.24%，the within-day relative standard deviation（RSD）of vancomycin was 0.95%～3.48%and the inter-day RSD was 3.59%～4.20%.The extraction recovery rates of theophylline in high，medium and low concentrations were 99.55%～103.46%，the objective recov-ery rates were 98.28%～99.76%，the within-day and inter-day RSD of theophylline was 0.95%～4.28% and 1.58%～3.80%respectively.Conclusion:The method is sensitive，selective，rapid，simple and accurate.It can be applied to testing clinical specimens and the study of pharmacokinetic.

RP-HPLC；Vancomycin；Theophylline；Monitoring of Blood Concentration

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.10.002

2015-06-10）

唐喆，女，硕士，主管药师。研究方向：药物分析。通讯作者E-mail：tjj870520@hotmail.com