车前草对呼吸道合胞病毒体外抑制作用的研究

黄筱钧，张朝贵

1．湖北民族学院医学院(湖北恩施445000)

2．湖北民族学院附属民大医院(湖北恩施445000)

呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)属于副粘病毒科肺炎病毒属，是引起婴幼儿和儿童下呼吸道感染最主要的病原体，每年约40%～50%住院治疗的婴幼儿毛细支气管炎和25%的婴幼儿肺炎是RSV感染所致。同时，RSV也常引起成人特别是老年人的呼吸道感染［1］。最常用药物利巴韦林因其毒副作用和耐药性，临床应用受到较大限制。目前尚无特效抗RSV药物，疫苗研究也无突破性进展。中国中药材资源极其丰富，开发治疗RSV感染的中药受到广泛关注。车前草为车前科多年生草本植物，主要化学成分是黄酮类、苯乙醇苷类、环烯醚萜及其苷类、三萜及甾醇类，具有降血脂、抗氧化、抗病原微生物等作用，对金黄色葡萄球菌、疱疹病毒、腺病毒都有一定的抑制作用［2］，抗呼吸道病毒的研究较少。为了进一步开发车前草的药效，本实验利用细胞培养技术和MTT法，以Hep-2细胞为细胞模型，对车前草醇提液体外抗RSV作用进行了研究。

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．1．1 药物 车前草购于恩施药材公司，为恩施道地药材，醇提法制备车前草冷藏备用。阳性对照药物利巴韦林注射液(100 g/L)，贵州天地药业责任有限公司生产(批号H20067579)。

1．1．2 细胞与病毒 人咽喉癌上皮细胞Hep-2为四川大学华西医学中心微生物教研室保存。细胞生长液为10%FBS MEM液，细胞维持液为2%FBS MEM液。呼吸道合胞病毒(RSV)Long株，由四川大学华西医学中心提供。

1．1．3 主要仪器 酶标仪(北京普朗新技术有限公司)，倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂)，CO2恒温培养箱(日本SANYO公司)，96孔细胞培养板(Becton Dickinson，USA)。

1．2 实验方法

1．2．1 RSV感染性滴度测定 Hep-2细胞复苏后传代3次，调整细胞为 1．0×104/mL，接种至 96孔板。用细胞维持液将RSV作10倍系列稀释，然后接种至Hep-2细胞，每孔0．1 mL，每一稀释度重复4孔，对照组加维持液，37℃、5%CO2培养2 h，更换细胞维持液。每天观察、记录各组细胞病变效应(CPE)，至CPE不再进展。按照Reed-Muench法计算病毒的半数细胞培养物感染量(TCID50)。

1．2．2 车前草对Hep-2细胞的毒性测定 以1．0g/mL车前草为原液，用细胞维持液倍比稀释，浓度为0．078、0．156、0．312、0．625、1．25、2．5、5．0、10 g/L，每孔0．1 mL，分别加入Hep-2单层细胞中，每一稀释浓度重复4孔，同时设阴性对照和阳性对照，37℃、5%CO2培养，每天观察CPE，并测定570 nm波长下的吸光度(A值)。

1．2．3 车前草对RSV体外抑制作用 实验分3组，抑制增殖组:0．1 mL 100TCID50RSV与单层Hep-2细胞37℃、5%CO2作用2 h，洗去未结合的病毒后加入不同浓度的车前草液;抑制吸附组:不同浓度车前草液与单层Hep-2细胞作用2 h，洗去未结合的车前草，加入 100 TCID50RSV;直接杀伤组:100TCID50RSV与不同浓度的车前草液37℃混合作用1 h，然后将混合液直接加入单层Hep-2细胞中孵育1 h，用PBS洗去未结合的病毒和药物，再加入细胞维持液。3组加样完成后37℃、5%CO2培养72 h。

1．2．4 CPE观察 “-”为细胞生长正常，无CPE产生;“±”为少于10%的细胞出现CPE;“+”为25%的细胞出现CPE;“++”为50%的细胞出现CPE;“+++”为75%的细胞出现CPE;“++++”为75%以上的细胞出现CPE。

1．2．5 MTT法 每日观察细胞生长情况，当病毒对照组CPE达到“++++”时，测定570 nm波长下的吸光度(A值)，计算出细胞存活率和病毒抑制率。细胞存活率=(药物组平均A值/细胞对照组平均A值)×100%，病毒抑制率=(实验组平均A值-病毒对照组平均A值)/(药物组平均A值-病毒对照组平均A值)×100%。

1．3 统计学处理 根据Reed-Muench法计算病毒的50%组织细胞感染量(TCID50)、车前草致Hep-2细胞半数中毒浓度(TC50)、车前草对RSV致Hep-2 CPE产生50%抑制的浓度，即车前草的半数有效量(IC50)，抗病毒指数 (TI)，TI=TC50/IC50。应用SPSS13．0统计软件，计量资料以均数±标准差(±s)表示，进行t检验及ANOVA检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 RSV感染性滴度测定 本实验使用的RSV Long株致 Hep-2 细胞 TCID50=10-8/0．1 mL。

2．2 车前草对Hep-2细胞的毒性测定 不同浓度的车前草接种于单层Hep-2细胞后细胞皱缩，呈圆形或椭圆形，壁增厚，折光性增强，5 d后Hep-2细胞脱落、碎裂，悬浮在培养液表面，吸光度值下降。随着车前草浓度的增加，对Hep-2细胞的毒性增强，死亡细胞数增加，细胞存活率下降。车前草和利巴韦林的 TC50分别为 4．57 g/L、0．38 g/L。

2．3 车前草对Hep-2细胞内RSV增殖的抑制作用车前草实验组CPE程度均低于病毒对照组，在浓度0．0625～8．0 g/L，随着药物浓度的增加，对 RSV 抑制率明显增高 (表1)。车前草抑制 RSV的 IC50=0．285 g/L，比TC50值小，说明车前草的使用安全，TI为 16．04。利巴韦林注射液 IC50=0．0356 g/L ，TI为10．67，车前草的安全性比实验用利巴韦林注射液高，车前草与利巴韦林对RSV在Hep-2细胞内的增殖作用差异无统计学意义(P＞0．05)。

2．4 车前草对RSV吸附Hep-2细胞的抑制作用车前草浓度为 1．0 g/L时 Hep-2细胞 CPE达到50%，4．0 g/L时25%细胞出现 CPE。

2．5车前草对RSV的直接杀伤作用 车前草浓度≥8．0 g/L时细胞生长良好，排列规则，仅有少量衰老细胞，病毒对照组CPE达到“++++”时，细胞内颗粒物增多，细胞变大，脱落，说明车前草对RSV具有直接杀伤作用。

表1 车前草和利巴韦林对RSV增殖的抑制作用±s，n=4)

表1 车前草和利巴韦林对RSV增殖的抑制作用±s，n=4)

车前草 利巴韦林浓度/g·L-1 CPE细胞存活率/%浓度/g·L-1 CPE细胞存活率/%0．0625 ++++ 2．01±1．01 0．025 ++++ 7．85±3．22 0．125 +++ 15．2±1．31 0．05 +++17．38±1．56 0．25 ++ 34．12±3．25 0．1 ++ 35．32±2．32 0．5 + 65．16±4．12 0．2 ++ 46．34±2．71 1．0 + 90．13±2．67 0．4 + 83．43±4．31 2．0 ± 95．32±2．22 0．8 ± 93．78±1．55 4．0 - 96．67±2．31 1．6 - 97．63±1．12 8．0 - 100 3．2 - 100

图1 车前草醇提液对RSV的吸附抑制和直接杀伤作用

3 讨论

人类的传染病约75%是由病毒引起的，但目前抗病毒的药物非常有限，且疗效不确定。中药治疗病毒感染性疾病尤其在免疫调节、抑制疾病的发展方面显示出优势，其来源广泛，价格便宜，毒性低，安全范围广，具有广阔的应用前景。实验研究发现甘草、龙胆、败酱草、连翘等对RSV有良好的抑制作用［3］。本实验在体外细胞水平研究了车前草醇体液抗RSV的作用，实验结果证实车前草使用安全，对RSV有明显的抑制作用，与利巴韦林抗病毒效果无显著性差异(P＞0．05)，细胞毒性比利巴韦林低，抗RSV指数比利巴韦林高，拓展了车前草的药效。浓度在 0．0625～8．0 g/L，随着车前草浓度的增加，对RSV的抑制率明显增高，药物在4．0 g/L时，CPE能完全抑制。

抗病毒药物主要作用于病毒复制周期(吸附、穿入、脱壳、生物合成、装配与释放)某个或多个环节，达到抗病毒的目的。车前草能干扰病毒致病的多个环节，不仅能抑制病毒的增殖，也阻断RSV感染和直接杀伤RSV，3组之间比较差异无统计学意义。车前草能抑制RSV的吸附过程，可能是其活性成分与RSV竞争结合Hep-2细胞表面的特异性受体，导致RSV吸附能力降低;车前草抑制RSV生物合成的可能机制是其成分竞争病毒复制酶和/或反转录酶，从而抑制病毒DNA的复制和转录过程;车前草也能直接杀灭病毒，可能是由于车前草含有能破坏RSV包膜的有效成分或活性化合物。已有研究证实中药能调节RSV感染引起的Th1/Th2失衡，抑制 IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ 的过表达来调控TLRS信号传导通路达到抗RSV感染的效果［3-5］。下一步将提取车前草的活性成分，进行各成分抗RSV研究，选择有效成分结合体内外实验从细胞因子和蛋白、基因水平探索车前草的抗病毒机制。

［1］ Cramer H．Antisense approaches for inhibiting respiratory syncystial virus［J］．Expert Opin Biol Ther，2005，5:207-220．

［2］ 杨亚军，周秋贵，曾红，等．车前草化学成分及新生物活性研究进展［J］．中成药，2011，33:1771-1776．

［3］ 张沛，赵霞．中医药对呼吸道合胞病毒感染Th1、Th2漂移影响的研究进展［J］．辽宁中医药大学学报，2010，12:38-40．

［4］ 李俊莲，李艳彦，高鹏，等．麻黄加术汤对呼吸道合胞病毒感染小鼠血清IL-2，IFN-γ的影响［J］．中国实验方剂学杂志，2013，19:196-199．

［5］ 李涛，戴启刚，汪受传．呼吸道合胞病毒与TLR3、TLR4的关系及其在中医药研究进展［J］．中华中医药杂志，2014，29:211-213．