基因多态性与中国闽南地区散发性帕金森病的相关性研究

·论著·

基因多态性与中国闽南地区散发性帕金森病的相关性研究

1)福建医科大学第一临床医学院福州3500012)厦门大学附属第一医院厦门361000

【摘要】目的研究SNCA(rs356221)、ITGA8(rs7077361)及LRRK2(rs1491942)基因单核苷酸多态性(SNP)与中国闽南地区汉族人群散发性帕金森病(Sporadic Parkinson’s Disease, SPD)的相关性。方法收集2011-08-2013-12厦门市第一医院神经内科门诊及住院确诊、临床资料完整、明确无血缘关系的SPD患者168例，健康对照组177例，运用SNaPshot技术对目标位点进行基因分型，采用χ2检验和Fisher确切概率法统计分析各SNP数据。结果(1)SPD组与对照组LRRK2基因rs1491942基因型频率和等位基因频率差异有统计学意义(P=0.008/0.007)，(CC+CG)与GG相比差异有统计学意义(P=0.003)；在各亚组中，LOPD(晚发型散发性帕金森病)组/女性组与对照组相比，差异均有统计学意义(P=0.006/0.001)。(2) SNSA(rs356221)、ITGA(rs7077361)基因型频率和等位基因频率差异均无统计学意义(P>0.05)。结论(1)LRRK2(rs1491942)基因单核苷酸多态性与中国闽南地区汉族女性晚发型散发性帕金森病发病相关，等位基因C可能是其发病的危险因素。(2) SNSA(rs356221)、ITGA(rs7077361)基因单核苷酸多态性可能与中国闽南地区散发性帕金森病发病无关。

【关键词】散发性帕金森病；单核苷酸多态性；SNCA；ITGA；LRRK2

基金项目：福建省自然科学基金重点项目(2012D062)

通讯作者方杰1) 郭名伟1)陈帅1)林青2)马琪林1,2)()

【中图分类号】R742.5

The associated research between gene polymorphism and sporadic Parkinson's disease in the Minnan region of China

FangJie＊,GuoMingwei,ChenShuai,LinQing,MaQilin

＊TheFirstClinicalMedicalCollegeofFujianMedicalUniversity,Fuzhou35001,China

Abstract【】 ObjectiveTo research the correlation between the SNP of SNCA(rs356221), ITGA8(rs7077361), LRRK2(rs1491942) and sporadic PD in the Minnan region of China. MethodsOne hundred and sixty eight inpatients and outpatients with complete clinical information of PD and without family history of PD, and one hundred and seventy seven healthy controls were respectively recruited at department of neurology and physical examination center in the first hospital of Xiamen from August 2011 to December 2013. The target gene loci was genotyped by the SNaPshot technique, and the SNP data were statistically analyzed by Chi-square test and Fisher exact probability method.Results(1) The genotype and allele frequencies of rs1491942 in LRRK2 showed statistically great difference between SPD group and control group (P=0.008/0.007), and there was statistically great significance between (CC+CG) and GG (P=0.003); According to age stratification and sex stratification, just LOPD and women's group showed statistically great difference compared with control group (P=0.006/0.001). (2) The genotype and allele frequencies of SNSA(rs356221)and ITGA(rs7077361)showed no statistically great difference between SPD group and control group (P=1.000).Conclusion(1)The SNP of LRRK2(rs1491942) may be related to late sporadic PD in women patients, and allele rs1491942-C may be a risk factor for Han Chinese in Minnan region. (2) The SNP of SNCA(rs356221) and ITGA8(rs7077361) may have nothing to do with SPD in the same area.

【Key words】Sporadic Parkinson's disease; Single Nucleotide Polymorphisms; SNCA; ITGA; LRRK2

帕金森病(PD)是一种常见于中老年人、发病率仅次于阿尔茨海默病的第二大神经变性疾病。临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍为主要特征。主要病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元大量变性缺失和神经细胞质内路易小体(Lewy body, LB)形成[1]。其发病机制尚未完全阐明，继1996年Polymeropoulos等[2]在意大利家系中发现了第一个帕金森病相关基因(SNCA，PARK1)后，共命名至少18个帕金森病相关基因，特别是近些年来随着全基因组关联研究(Genome Wide Association Studies,GWAS)的成熟，与帕金森病相关的易感基因位点不断被发现，在不同人群、种族研究中被证实。目前世界各地区对SNCA(rs356221)、ITGA8(rs7077361)及LRRK2(rs1491942)基因单核苷酸多态性与帕金森病的相关性报道并不一致，目前中国大陆地区无关于SNCA(rs356221)、ITGA8(rs7077361)与SPD的报道，本研究旨在探讨以上3个SNP位点与散发性帕金森病的相关性，为进一步研究帕金森病的遗传机制提供依据。

1对象和方法

1.1对象(1)SPD组：收集2011-08-2013-12就诊于厦门大学附属第一医院神经内科门诊及病房诊断的临床资料完整、无血缘关系的SPD患者168例，男94例(55.95%)，女74例(44.05%)；平均年龄(57.02±8.363)岁。诊断标准根据国际公认的1992年英国帕金森病协会脑库诊断标准进行诊断[3]。(2)对照组：来自厦门大学附属第一医院健康体检志愿者177例，男96例，女81例；平均年龄(57.64±9.27)岁。2组性别、年龄、种族、居住地无显著相关性(P>0.05)。2组人群均来自中国闽南地区汉族人群，主要包括厦门、泉州、漳州、莆田、三明、龙岩等地区SPD患者，本实验研究经过医院伦理委员会的同意，所有受试者均签订知情同意书。

1.2 方法

1.2.1样本采集：抽取外周静脉血2 mL，使用天根基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取DNA，测DNA浓度和纯度，将符合要求的DNA样品存于-20 ℃备用。

1.2.2引物设计：用引物设计软件Primer 5.0设计引物，长度在200～500 bp，Tm值在60 ℃左右，并针对各位点的3’端前一个碱基设计一段位点探针。为区分不同的位点，在引物的5’端加poly(dT)、poly(dA)、poly(dC)或poly(dGACT)尾巴。引物具体信息如表1。

1.2.3PCR扩增体系：采用模板DNA 1 μL，10×PCR Buffer (Mg2+free) 2 μL，MgCl2(50 mM)0.8 μL，dNTP(10 mM)0.5 μL，Primer Mix 0.5 μL，Platinum Taq (5 U) 0.5 μL，ddH2O 14.7 μL共20 μL反应体系，使用预变性95 ℃ 2 min，变性 95 ℃ 20 s、退火55 ℃ 30 s、延伸 72 ℃ 40 s共33个循环，终延伸 72 ℃ 5 min的扩增过程，反应结束后吸取PCR产物5 μL及1 μL 6×loading buffer(2×溴芬兰)混合，置于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带清晰，大小正确。

1.2.4SNaPshot延伸反应：按照SNaPshot Multiplex Kit试剂盒说明书进行。

1.2.5延伸产物的纯化：使用虾碱酶进行产物纯化，加入产物后震荡混匀，37 ℃保温1 h，75 ℃保温15 min灭活SAP酶，4 ℃保存24 h。

1.2.6ABI PRISM 3730测序分析：向96孔板中加入1 μL上述纯化延伸产物，与Gene scanTM-120LIZ Size Standard 0.5 μL和去离子甲酰胺8.5 μL混合均匀后，95 ℃变性5 min，直接进行3730扫板。

表1　PCR和SNaPshot引物

1.3统计学分析所有资料使用SPSS 20.0软件进行统计学分析，采用不同组别及亚组中性别、年龄等基本特征比较采用独立样本t检验，指标结果用均数±标准差(±s)表示；Hardy-Weinberg遗传平衡用χ2检验检测；χ2检验比较各组及各亚组基因型频率和等位基因频率；比值比(odds ratios，OR)及95%可信期区间(confidence intervals，CI)用于说明单位点基因突变发生PD的风险是未突变的倍数。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1测序扫描图见图1。

图1从左至右为位点rs36221、rs7077361、rs1491942的测序结果，依次为T、T、G

2.2 Hardy-Weinberg平衡吻合度检验为检验3个多态性位点基因型频率分布是否平衡，分别对SPD组和对照组基因型进行吻合度检验。结果表明：SPD组和对照组中SNCA(rs356221)、ITGA8(rs7077361)、LRRK2(rs1491942)基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡法则，吻合度良好，提示样本对总体的代表性良好。

2.3基因型频率、等位基因频率分析(1)SNCA(rs356221)位点SPD组与对照组相比基因型频率无显著差异(P=0.398)，等位基因频率差异无统计学意义(P=0.139)。(2) ITGA8(rs7077361)位点SPD组与对照组相比基因型频率无显著差异(P=1.000)，等位基因频率无显著差异(P=1.000)。(3)LRRK2(rs1491942)位点SPD组与对照组相比基因型频率有显著差异(P=0.008)，等位基因频率也有显著差异(P=0.007,OR=0.62，95%CI=0437～0.880)；进一步分析CC+GC的累加效应，含C等位基因和不含C等位基因在2组间的比较有显著差异(P=0.003,OR=1.945,95%CI=1.246～3.307)；按年龄将SPD组分为早发性PD(EOPD，年龄<50岁)和晚发性PD(LOPD，年龄≥50岁)，与同样按年龄分层的对照组相比，EOPD组基因型频率有显著差异(P=0.008)，等位基因频率无显著差异(P=0.237)，LOPD组基因型频率有显著差异(P=0.035)，等位基因频率有显著差异(P=0.006,OR=0.549,95%CI=0.358～0.843)；按性别分层对2组进行分析，男性组基因型频率和等位基因频率均无显著差异(P=0.209/0.586)，女性组基因型频率有显著差异(P=0.005)，等位基因频率有显著差异(P=0.001,OR=0.44，95%CI=0.27～0.715)。见表2。

表2　SNCA(rs356221)、ITGA(rs7077361)、LRRK2

3讨论

SNCA基因单核苷酸多态性位点可位于SNCA的启动子、内含子区域，也可位于SNCA的3’端，rs356221位于SNCA基因的3’端。台湾的一项研究[4]发现rs356221与PD相关(P<0.02)，2006年日本的一项研究[5]发现rs356221与PD发病具有很强的相关性(P<0.01)，2007年欧洲的一项研究[6]显示了同样结果(P=0.021)，同年爱尔兰的研究[7]显示rs356221与PD无相关性(P=0.32)，本研究结果同样显示rs356221与中国闽南地区汉族人群SPD无相关性，至于为什么与亚洲其他地区特别是和闽南血缘关系较近的台湾地区的研究结果不一致，可能需要更大样本量的研究。

ITGA8是新近发现的1个PD相关基因，位于染色体10p13，其表达产物为整合素蛋白α-8，为I型转膜蛋白，主要表达于脑[8]，介导细胞间相关作用及运动和感觉神经元的突触生长[9]。其中多态性位点rs7077361，在2009年由Simon-Sanchez等[10]发现与PD发病风险相关(P= 1.3×10-8)。之后多项对高加索人进行的GWAS研究均发现rs7077361是这个区域与PD发病风险相关性最强的基因[11]。但本次研究SPD组未发现1个杂合子或突变子，对照组发现1个杂合子，重新审核该研究对象相关资料，确认无PD家族史，个人也无PD相关症状。因此，ITGA(rs7077361)基因单核苷酸多态性可能与中国闽南地区散发性帕金森病发病无关。

LRRK2基因是目前被鉴定与帕金森病相关性最强的基因[12]。到目前为止，已发现30多个与PD相关的LRRK2基因多态性位点，2012年美国国立卫生协会针对美国及西班牙PD患者进行大样本的LRRK2多态性位点分型研究，共检测了66个常见的多态性位点，发现多个SNP与PD相关[13]，同时Lill等[14]搜集美、日、英、法等国家的资料进行大样本Meta分析显示 rs1491942与PD有显著相关性(P=6.44×10-15),同年芬兰针对年轻PD患者(≤55岁)的一项研究[15]发现，rs1491942与PD发病风险无明显相关性(P=0.367)。赵辉等[16]针对rs1491942位点在中国淮海地区搜集了152例晚发SPD患者和160例对照，分析结果显示与PD相关(P=0.006)，且C等位基因为危险因素。本研究结果同样表明rs1491942多态性位点与SPD相关，等位基因C为致病危险因素，与国内研究结果一致。我们进一步对性别及起病年龄进行分层，结果表明rs1491942与LOPD相关，与EOPD不相关，rs1491942与女性组相关，与男性组不相关。因此，LRRK2(rs1491942)基因单核苷酸多态性与中国闽南地区汉族女性晚发型散发性帕金森病发病相关，等位基因C可能是其发病的危险因素。

SNP在人基因组中发生频率较高，每1 000个碱基中可能就有1个多态位点，用于确定基因多态性与疾病的关系及解释个体间表型的差异对疾病的易感程度，然而其具有种族、地域、环境差异，本研究结果也反映了这一点。本研究也可能存在选择性偏倚，尚需更大样本量的分析，从而为PD的发病机制研究提供更多的基因学基础。

4参考文献

[1]Hansen C, Li JY. Beyond a-synuclein transfer pathology propagation in Parkinson's disease[J].Trends Mol Med,2012,18(5):248-255．

[2]Fahn S. Description of Parkinson's disease as a clinical syndrome[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2003, 991(1): 1-14.

[3]Hughes AJ, Daniel SE, Kilford L, et al. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson's disease: a clinicopathological study of 100 cases[J]. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry, 1992, 55(3): 181-184.

[4]Wu-Chou YH, Chen YT, Yeh TH, et al. Genetic variants of SNCA and LRRK2 genes are associated with sporadic PD susceptibility: a replication study in a Taiwanese cohort. Parkinsonism & related disorders, 2013,19(2): 251-255.

[5]Mizuta I, Satake W, Nakabayashi Y, et al. Multiple candidate gene analysis identifies α-synuclein as a susceptibility gene for sporadic Parkinson's disease[J]. Human molecular genetics,2006,15(7): 1 151-1 158.

[6]Winkler S, Hagenah J, Lincoln S, et al. α-Synuclein and Parkinson disease susceptibility[J]. Neurology, 2007,69(18): 1 745-1 750.

[7]Ross OA, Gosal D, Stone JT, et al. Familial genes in sporadic disease: Common variants of α-synuclein gene associate with Parkinson's disease[J]. Mechanisms of ageing and development, 2007,128(5): 378-382.

[8]Myers AJ, Gibbs JR, Webster JA, et al. A survey of genetic human cortical gene expression[J].Nature genetics, 2007,39(12): 1 494-1 499.

[9]Venstrom K， Reichardt L. Beta 8 integrins mediate interactions of chick sensory neurons with laminin-1, collagen Ⅳ, and fibronectin[J]. Molr Biol Cell, 1995, 6(4): 419-431.

[10]Simon-Sanchez J, Schulte C, Bras JM, et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease[J]. Nature Genetics, 2009,41(12): 1 308-1 312.

[11]Nalls MA, Plagnol V, Hernandez DG, et al. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease:a meta-analysis of genome-wide association studies[J]. Lancet, 2011, 377(9 766): 641-649.

[12]Dachsel JC,Farrer MJ.LRRK2 and Parkinson’s disease[J]. Archives of Neurology,2010,67(5):542-547.

[13]Mata IF, Checkoway H, Hutter CM, et al. Common variation in the LRRK2 gene is a risk factor for Parkinson's disease[J]. Movement Disorders, 2012,27(14): 1 823-1 826.

[14]Lill CM, Roehr JT, McQueen MB, et al. Comprehensive research synopsis and systematic meta-analyses in Parkinson's disease genetics: The PD Gene database[J]. PLoS Genetics, 2012,8(3): e1002548.

[15]Hernandez DG, Nalls MA, Ylikotila P, et al. Genome Wide Assessment of Young Onset Parkinson’s Disease from Finland[J]. PloS One, 2012, 7(7): e41859.

[16]赵辉,董丽果,牟英峰,等.帕金森病患者 PINK1 LRRK2 基因单核苷酸多态性分析[J]. 中国实用神经疾病杂志, 2013,16(24):1-3.

(收稿2014-09-23)