猪圆环病毒2型病毒样颗粒研究进展

谢小红，胡　意（湖南农业大学，湖南长沙　410128）

猪圆环病毒2型病毒样颗粒研究进展

谢小红，胡意
（湖南农业大学，湖南长沙410128）

猪圆环病毒2型（PCV2）是引起猪圆环病毒相关疾病的主要病原体，给养殖业造成重大经济损失。一直以来，对于PCV2的防控主要通过疫苗接种。目前使用的疫苗可大致分为全病毒灭活疫苗、嵌合病毒疫苗、重组亚单位疫苗三大类。病毒样颗粒（VLPs）作为一种伪病毒，以其高免疫原性、高安全性成为新型疫苗的研究热点。本文综述了VLPs在国内外的最新研究动态、研究和开发的意义，提出了VLPs作为一种基因转载工具，其研究为疫苗研发开拓了新的方向。

猪圆环病毒；亚单位疫苗；病毒样颗粒

1　PCV2的社会危害

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）首次发现于1974年，由Tischer等[1]在猪肾上皮细胞系（PK-15）的污染物中被分离到。由于当时其并不引起猪的疾病，所以未受到太多关注，真正被世人熟知是在二十世纪末。当时在猪场流行一种被称为断奶仔猪多系统衰竭综合征（Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的疾病。加拿大的Clark在报道患有此病的仔猪体内分离到一种有别于PK-15细胞培养污染物中分离的猪圆环病毒（PCV1）的变种，它能引起猪的相关疾病，为了与之前发现的PCV1相区别，将这种能使猪致病的圆环病毒命名为圆环病毒2型（Porcine Circovirus 2，PCV2）。自发现以来，PCV2在全球范围内大规模暴发并迅速蔓延，给全球养殖业造成了重大经济损失。学者们将PCV2在猪群中引起的一系列疾病统称为猪圆环病毒相关疾病（PCVAD），主要包括断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）、猪的相关性肠炎与肺炎、仔猪先天性颤动（CT）以及母猪的繁殖障碍等[2]。PCV2单独感染并不会引起猪群明显的病症，但当其与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）或猪细小病毒（PPV）等病原体并发感染时，会导致猪群大规模发病，而且还会造成机体免疫抑制，使患病猪对病原体的自身抵抗力下降，进而导致病症加重。

2　PCV2的结构特点

PCV2属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus），是一种小型无包膜的单链正股环状DNA病毒，分子量为0.58×106Da[3]。病毒颗粒呈二十面体，平均直径在17 nm左右[4]，是世界上发现的较小动物病毒之一。其基因组含有大约1 767～1 768个碱基，包含3个主要的开放阅读框（ORFs），编码三个主要的蛋白质（Rep、Rep′、Cap）。衣壳蛋白Cap由ORF2编码，基因组全长702 bp，含有233个氨基酸，分子量在27 kDa左右，是病毒颗粒唯一的结构蛋白和免疫原性蛋白，能刺激机体产生持久的体液免疫和细胞免疫。该蛋白的N端存在一个核定位信号，由41个高度保守的氨基酸序列组成，且此区富含碱性氨基酸（如精氨酸），对于病毒在细胞核内的定位必不可少。研究表明核定位信号区域的12RHRPRSH18和34HRYRWRRK41残基与PCV2 ORF2的亚细胞定位密切相关[5]。利用合成肽技术鉴定PCV2 Cap蛋白上的抗原位点，发现了5个精确的线性B细胞抗原表位，分别为92-103aa、156-162aa、175-192aa、195-201aa和231-233aa，并获悉233位脯氨酸是PCV2特异的关键氨基酸位点[6]。

3　PCV2疫苗的使用情况

疫苗免疫已成为猪场预防和控制PCV2感染的最佳选择。从我国疫苗种类来看，预防 PCV2感染的疫苗种类繁多。这些疫苗大致可分为三大类：全病毒灭活疫苗、嵌合病毒疫苗、重组亚单位疫苗。全病毒灭活疫苗是利用甲醛等试剂将全病毒毒株灭活后加入佐剂制备而成。法国Merial公司的PCV2a全病毒灭活疫苗Circovac ®最先开始推向市场，用于繁育母猪和三周龄以上仔猪，其在减少感染量和减轻临床症状方面表现出较好的临床效果。PCV2全病毒灭活疫苗具有免疫原性好、保护力确切等优点，但是制备全病毒灭活疫苗需要培养大量的病毒，而普通的细胞培养很难得到高滴度的PCV2，且由于 PCV2不同亚型间的交叉保护力不强，一旦毒株变异，疫苗的保护力就大打折扣。

嵌合病毒疫苗是应用基因工程手段将不致病的PCV1 ORF1基因用致病的ORF2的基因片段替换[7]，构建重组基因，表达多种病原体抗原的一类新型疫苗。由于该嵌合病毒含有PCV2的ORF2，可以在宿主体内表达成相应的Cap蛋白，刺激宿主细胞产生特异性免疫反应。不过嵌合病毒疫苗存在免疫持续期短、制备成本大的缺陷，还可能存在一定的导致PCV2变异株产生的潜在风险。

重组亚单位疫苗是将 PCV2 ORF2基因插入的表达载体中，表达出具有PCV2免疫原性的Cap蛋白，再将纯化的蛋白加入免疫佐剂制备而成。近年来国内一些研究者开展了大量的 PCV2亚单位疫苗研发课题。张永武[8]等利用杆状病毒表达系统成功表达了 PCV2的 Cap 蛋白；张家明[9]等用Cap 蛋白制备的亚单位蛋白疫苗在小鼠体内进行免疫试验，发现其能诱导动物产生特异性抗体，证明PCV2亚单位蛋白疫苗能为动物提供有效保护。但是由于常规的亚单位疫苗中的靶蛋白在制备过程中存在无法正确折叠，或者给动物接种时无法充分被抗原递呈细胞识别摄取等问题，因此相比于弱病毒疫苗，其免疫源性稍差一些。

4　PCV2病毒样颗粒的研究进展

近年来的不少研究发现，某些病毒的结构蛋白能在细胞内自主组装成不含病毒核酸的空心颗粒，它们在形态上与真正病毒粒子相同或相似，被称为病毒样颗粒（Virus-like particles，VLPs）。根据其天然病毒构造，大致将VLPs分为无包膜VLPs和有包膜VLPs两类。有包膜VLPs除含有衣壳蛋白外，其外层还被一层宿主细胞膜包围。无包膜VLPs通常由一种或多种病毒衣壳蛋白组装而成，其形态和结构规则完全可以模拟天然病毒的结构。在近几十年里，VLPs作为一种有效的表位展示载体及新型亚单位疫苗，具有免疫源性好、安全性高等优势，作为展示载体能与其他病毒重组成多价苗或联苗，成为新型疫苗的研究热点和开发方向。许多人类和动物的病毒都可以形成VLPs[10-12]，如细小病毒VLPs[13-14]、人乳头瘤病毒VLPs[15]、鼠多瘤病毒VLPs[16]等。由于VLPs在形态结构上与天然的病毒粒子有极强相似度，与其他类型的亚单位疫苗相比，更容易被抗原递呈细胞捕捉并呈递给免疫系统。且其几乎不含病毒基因组，在宿主细胞内无复制增殖能力，完全避免了灭活苗和弱毒苗在动物机体内潜在的返祖、变异或散毒等风险，具有更高的安全性。VLPs表面能够以高密度的方式展示病毒的主要抗原表位，有利于其被抗原递呈细胞尤其是树突细胞（Dendritic Cells，DCs）捕捉摄取，进而有效刺激CD4+T细胞以及CDB+细胞毒性T细胞的免疫反应。在无佐剂情况下仍可被DCs摄取，并促进DCs的成熟和迁移，从而刺激机体产生高效的体液免疫和细胞免疫应答[17]。相比于常规的亚单位重组蛋白，VLPs可刺激机体引发更高效、持久、广泛的体液免疫反应和细胞免疫反应。基于VLPs独有的免疫特性，其作为一种理想的疫苗开发形式受到广泛关注。

5　PCV2 病毒样颗粒的现阶段国内外研究动态

目前采用昆虫-杆状病毒（Sf9-Baculovirus）表达系统已经成功表达出PCV2 Cap蛋白[18]，密度梯度离心后可以得到较高浓度和纯度的PCV2 VLPs。将其制备成PCV2 VLPs新型亚单位疫苗后接种易感动物，也得到很好的免疫效果。自PCV2 VLPs亚单位疫苗投入使用后，猪群中PCV2流行情况得到较为有效的控制，成为国际市场上控制PCV2的主要疫苗类型。不过利用昆虫-杆状病毒系统表达PCV2 Cap蛋白的工艺还不够完善，使得生产程序复杂，价格昂贵，导致亚单位疫苗投入生产受到很大限制。如果利用原核表达系统等生产PCV2 VLPs将大幅度降低PCV2 VLPs的生产成本。由此可见，影响VLPs制备的关键因素就是衣壳蛋白表达系统的选择及优化[19]。在不同表达系统表达的病毒衣壳蛋白会有不同的特征，从而影响其自主组装折叠[20]。很多研究者利用大肠杆菌表达系统生产PCV2的Cap蛋白质，并计划将其在体外自主组装折叠成VLPs，但结果显示得到的Cap蛋白并未成功组装成VLPs[21]。2013年，Yin等[22]在PCV2 ORF2基因5’端插入一个Sumo-融合标签，极大程度地提高了Cap蛋白在原核表达系统大肠杆菌中的表达效率，将纯化后的蛋白用酶切技术去除Sumo-融合标签后能在体外自主组装折叠成VLPs。这些实验结果表明，利用原核表达系统表达及组装Cap VLPs 是可能的，但其表达和组装机理较昆虫-杆状病毒表达系统复杂，有待进一步研究。目前在国内外，对PCV2 VLPs的组装机理研究甚少，对于下游PCV2 VLPs作为基因运载体的研究与应用更是少见。

6　PCV2 病毒样颗粒研究和开发的意义

由于PCV导致的相关疾病会对猪的免疫系统造成严重破坏，与其他病原体继发感染导致病猪症状加重，在外界多种因素的刺激下，接种疫苗不当还会引发断奶仔猪多系统衰竭综合征，因此开发出对猪刺激小、安全性好、廉价高效的PCV2疫苗产品已经成为疫苗生产工业的一大挑战。VLPs疫苗与传统的亚单位疫苗相比，只需要低剂量的有效抗原就能刺激机体产生免疫反应，达到与全病毒相似的免疫效果，且对机体产生更弱的应激反应。VLPs的这些免疫特性使其在新型疫苗研究中受到极为广泛的关注。早在上世纪七十年代末就有文献报道鼠多瘤病毒的假衣壳颗粒可以包裹裸露的DNA，暗示着假衣壳有携带DNA的潜质[23]。二十一世纪初，不少文献报道了人乳头状病毒VLPs和鼠多瘤病毒VLPs可以包裹一定长度的外源性DNA，并可将其带入宿主细胞内[24-25]。有研究证明人乳头状病毒VLPs能有效携带siRNA分子进入到靶细胞，对人类宫颈癌的治疗可起到有效的临床作用[26]。

PCV2 VLPs与其他病毒VLPs相比，具有十分独特的优势。很多病毒包含两个或者多种不同的衣壳蛋白质，因而其VLPs 的蛋白表达和组装过程更为复杂繁琐。而PCV2 VLPs结构简单，仅由病毒唯一一种结构蛋白（Cap）构成，组装过程中只需要表达一种蛋白质，这就使得PCV2 VLPs制备工序和组装难度大大降低。Khayat等[27]通过对PCV2衣壳蛋白的深入研究，已将其Cap 蛋白质的三维晶体结构解析出来，为对PCV2 VLPs的结构研究提供了基础。目前研究表明PCV2主要以硫酸乙酰肝素（HS）和硫酸软骨素（Chon-droitin sulfate B，CS-B）作为广谱性受体[28]，对大多数哺乳动物细胞都具有侵染性。这些优势暗示着PCV2 VLPs也可以和乳头状病毒VLPs一样，作为一种基因运载体，携带药物分子、siRNA或外源基因进入细胞。基于PCV2 VLPs的诸多优势，在生物学研究和临床疫苗方面，对其进行深入研究和开发具有十分重要的指导意义。

7　结语

从目前形势来看，PCV2亚单位疫苗的接种，对于猪圆环病毒相关疾病的预防和控制起到一定的良性作用。在临床应用上，PCV2 VLPs作为一种新型的亚单位疫苗，保持了病毒颗粒表面抗原蛋白的天然构象，几乎不含病毒基因组，具有同天然病毒相似的免疫源性，且更安全高效，是目前新型病毒疫苗研究的热点和重点。目前PCV2 VLPs的组装及包裹外源物质的机理尚未被完全了解，且其具有的其他生物学意义也还没有被完全挖掘出来，但是作为一种基因转载工具，PCV2 VLPs为疫苗研发开拓了新的研究方向。

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（责任编辑：朱迪国）

Research Progress on Virus-like Particles of Porcine Circovirus Type 2

Xie Xiaohong，Hu Yi
（Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan410128）

Porcine circovirus type 2（PCV2）is the main etiological agent of PCV2-associated diseases（PCVAD），causing enormous economic loss in pig industry. By far，vaccination is the major prevention and control measure against PCVAD. There are three kinds of vaccines applied in production at present，including inactivated whole-virus vaccine，mosaic virus vaccine and recombinant subunit vaccine. As a type of“fake”virus，PCV2 VLPs（viruslike particles）has become a hot research topic in the development of new vaccines，due to its advantages of better immunogenicity and higher security than traditional vaccines. In this article，the newest research trends and significance of research and exploitation were given a review. At the end，a conclusion was drawn：as a tool of genetic transfer vector，the research of VLPs would open up a new direction for the vaccine research and development.

porcine circovirus；subunit vaccine；virus-like particles

S851.3

A

1005-944X（2016）12-0060-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.12.018