人脑胶质瘤组织中高迁移率族蛋白B1的表达及其与病理分级的关系

张元峰　孙瑞迅　董孟宁　孙保朝

(南阳市中心医院神经外科，河南　南阳　473000)



人脑胶质瘤组织中高迁移率族蛋白B1的表达及其与病理分级的关系

张元峰孙瑞迅董孟宁孙保朝1

(南阳市中心医院神经外科，河南南阳473000)

目的探讨人脑胶质瘤组织中高迁移率族蛋白(HMG)B1的表达及其与病理分级的关系。方法选取外科手术治疗后经病理证实的脑胶质瘤标本80例为研究组，另外选择同期25例行开颅减压手术的脑外伤患者的正常脑组织为对照组。采用RT-PCR法和免疫组化法检测人脑胶质瘤组织和正常脑组织中的HMGB1表达，分析表达差异性与病理级别的关系。结果实验组HMGB1基因表达量(25.371±2.837)明显高于对照组(6.074±3.309)(P<0.05)；HMGB1蛋白阳性表达率为75.00%，高于正常脑组织中的20.00%(P<0.05)；在病理分级中，实验组的Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组HMGB1 mRNA表达量(29.835±3.942)显著高于Ⅰ～Ⅱ级(21.332±2.253)(P<0.05)，Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组HMGB1蛋白阳性表达率(76.92%)高于Ⅰ～Ⅱ级(70.73%)(P<0.05)。结论HMGB1在人脑胶质瘤的临床治疗中具有重要指导意义。

胶质瘤；高迁移率族蛋白(HMG)B1

胶质瘤多发于成年男性，主要表现为脑神经功能受损及颅内压升高，不同类型胶质瘤的发生发展规律不同，给临床治疗造成很大的障碍〔1，2〕。目前临床上主要通过外科手术、放疗及化疗治疗脑胶质瘤，但是胶质瘤发病急，病情进展迅速，具有免疫逃避功能，与正常脑组织基本无异，即使经过长时间的治疗，复发率依然居高不下，患者的5年生存率不足20%〔3〕。高迁移率族蛋白(HMG)B1主要存在于真核生物细胞内，是一种分布于脑、心、肝、脾及淋巴组织的非组蛋白染色体结合蛋白，参与包括基因转录、DNA修复等生物学过程〔4〕。有研究表明 HMGB1的表达与肿瘤的发生、增殖、浸润、转移和血管生成等生物学行为联系紧密〔5〕。本研究探索人脑胶质瘤组织中HMGB1的表达及其与病理分级的关系。

1　对象与方法

1.1标本来源选取2013年5月至2015年4月我院外科手术治疗后经病理证实的脑胶质瘤标本80例作为研究组，所有病例均为首次发病且接受手术治疗，术前未进行化疗、放疗及其他治疗，患者未患其他重大疾病，临床资料完整。男45例，女35例；年龄42～71岁，平均(55.85±23.85)岁；病程2～8年，平均(4.87±3.13)年；根据WHO在2007年制定的神经系统肿瘤的分类和分级标准〔6〕：低级别胶质瘤(LGG)(Ⅰ、Ⅱ级)41例，其中室管膜瘤12例，毛细胞型星形细胞瘤8例，少突胶质细胞瘤8例，弥漫型星形细胞瘤13例；高级别胶质瘤(HGG)(Ⅲ、Ⅳ级)39例，其中胶质母细胞瘤9例，间变形室管膜瘤7例，间变形星形细胞瘤10例，髓母细胞瘤5例，恶性少突胶质细胞瘤8例。选择同期25例我院神经外科行开颅减压手术的脑外伤患者的正常脑组织作为对照组，男15例，女10例；年龄37～75岁，平均(55.47±5.18)岁。两组患者的性别及年龄无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。所有样本取出后立即置入液氮罐保存，试验过程经伦理委员会通过，所有患者均签署知情同意书。

1.2试剂及仪器

1.2.1RT-PCR采用总RNA快速抽提试剂盒提取总RNA，购自天根生化科技有限公司；cDNA合成采用cDNA合成试剂盒，购自MBI Ferments；应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测HMGB1的表达，试剂盒购自Shino-Test Corporation；Taq DNA聚合酶、d-NTP、10倍缓冲液、25 mmol/L MgCl2购自天根生化科技有限公司；HMGB1和GAPDH引物及Taq Man探针序列由天根生化科技有限公司设计；德国SPECTRO公司的紫外分光光度计，澳大利亚Kyratec公司的荧光定量PCR及美国Beckman公司的高速离心机。

1.2.2免疫组化HMGB1单克隆抗体购自美国sigma公司，二抗试剂盒及DAB显色试剂盒购自上海拜沃生物科技有限公司，荧光显微镜由日本Nikon公司提供。

1.3方法

1.3.1RT-PCR(1)提取总RNA和反转录合成cDNA：严格按照说明书的要求进行操作，使用紫外分光光度计检测RNA 浓度。(2)实时定量 PCR 检测：采用天根生化科技有限公司设计的HMGB1和GAPDH引物及Taq Man 探针序列。第一阶段95℃预变性5 min；第二阶段95℃变性5 s，60℃退火延伸15 s，循环30次；最后40℃终止30 s。每一份标本的HMGB1基因表达量=HMGB1拷贝数/GAPDH拷贝数。

1.3.2免疫组化(1)将标本进行预处理后置于载玻片上，加入单克隆抗体后4℃过夜，使用PBS清洗2次，加入二抗，室温孵育30 min。滴加过氧化物酶标记，室温孵育15 min。(2)使用DAB进行显色，使用清水冲洗两次，苏木精复染，常规脱水透明，中性树胶封片，显微镜下观察。阴性对照使用空白PBS液体。(3)在视野范围内观察切片免疫反应强的区域，在高倍镜(400倍)下观察5个不重复视野，统计HMGB1阳性细胞数目，取平均值。结果判定标准：染色结果细胞核呈蓝色，阳性表达为黄色或黄棕色。阴性：无阳性细胞或阳性细胞数≤5%；阳性：阳性细胞数<5%。

1.4统计学方法采用SPSS16.0软件行t或χ2检验。

2　结　果

2.1HMGB1基因的表达比较实验组HMGB1基因表达量(25.371±2.837)明显高于对照组(6.074±3.309)(P<0.05)；Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组织HMGB1 mRNA表达量(29.835±3.942)明显高于Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤组织(21.332±2.253)(P<0.05)。

2.2HMGB1蛋白免疫组化结果比较胶质瘤组织中的HMGB1阳性表达率为75.00%(60/80)，明显高于正常组织中的20.00%(5/25)(P<0.01)；在病理分级中，Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组织阳性表达率〔76.92%(31/39)〕显著高于Ⅰ～Ⅱ级的70.73%(29/41)(P<0.05)。

3　讨　论

胶质瘤是颅内最常见且发病率和病死率最高的恶性肿瘤，临床治疗效果不显著，预后差。主要是由于胶质瘤生长迅速，快速侵入周围组织间隙、淋巴管及血管，破坏周围正常组织，与邻近正常组织无明显界限，通过手术难以彻底切除，易复发〔7，8〕。HMGB1具有较小的分子质量(<30 kD)和很高的电泳迁移率。人HMGB1基因在染色体13q12区域，可以编码219个氨基酸，主要分为三个功能区：A区和B区主要为赖氨酸，其N-末端富含带正电荷；C区主要为天冬氨酸和谷氨酸，其C-末端富含带负电荷〔9〕。HMGB1可以通过影响起始复合物的形成增强基因的表达，同时可以通过影响增强体的形成调节基因转录过程；另外，HMGB1可造成启动子和增强子的增强体的结合位点上DNA序列发生变化，促进其他转录因子的结合〔4〕。本研究中，胶质瘤组织中HMGB1基因和蛋白表达明显升高，说明其在胶质瘤的发生、发展中起重要作用，外国学者研究证实HMGB1在肿瘤晚期的表达率为80%，高于其在肿瘤早期的表达率〔10〕，这与我们发现的病理分级对表达的影响也有相同的地方。HMGB1参与肿瘤发生的机制目前还不是很明确，众多研究结果发现其可能是通过调节基因的表达从而发生肿瘤表型〔11〕，或者HMGB1可以使肿瘤表型的细胞躲避凋亡，激活JAK/STAT途径，进而抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞过度增殖〔12〕。Bassi等〔13〕发现HMGB1可以激活RAGE，表明胶质瘤中存在HMGB1/RAGE信号通路，HMGB1可以通过与RAGE结合，上调RAGE的表达，从而导致细胞外基质降解，使肿瘤出现浸润和转移，促进肿瘤的发展。此外，HMGB1还可以促进肿瘤细胞增殖，诱导小血管再生，促进肿瘤不断增大〔14〕。

1姜方帅.HMGB1、NF-κB及TNF-α在人脑胶质瘤中的表达及临床意义〔D〕.长沙：中南大学，2014.

2Gass D，Dewire M，Chow L，etal.Pediatric tectal plate gliomas：a review of clinical outcomes，endocrinopathies，and neuropsychological sequelae〔J〕.J Eurooncol，2015；122 (1)：169-77.

3郭兆刚.siRNA法下调PRL-3对脑胶质瘤细胞SHG-44生长周期的影响〔D〕.沈阳：中国医科大学，2014.

4Ito H，Fujita K，Tagawa K，etal.HMGB1 facilitates repair of mitochondrial DNA damage and extends the lifespan of mutant ataxin-1 knock-in mice〔J〕.EMBO Mol Med，2014；7(1)：78-101.

5张志军，彭传会，周琳，等.高迁移率族蛋白B-1的肿瘤生物学效应研究进展〔J〕.中华外科杂志，2012；50(3)：274-7.

6陆新宇，陆培松，李巧玉，等.人脑胶质瘤中神经生长因子表达与组织病理分级及预后的关系〔J〕.中华实用诊断与治疗杂志，2012；26(10)：958-60.

7杨李轩，张弩，夏之柏，等.影响恶性胶质瘤生存预后的临床因素分析〔J〕.中华神经医学杂志，2012；11(8)：784-7.

8Joel M，Mughal AA，Grieg Z，etal.Targeting PBK/TOPK decreases growth and survival of glioma initiating cells in vitro and attenuates tumor growth in vivo〔J〕.Mol Cancer，2015；14：121.

9Kim B，Song JH，Lee M.Combination of TAT-HMGB1A and R3V6 amphiphilic peptide for plasmid DNA delivery with anti-inflammatory effect〔J〕.J Drug Target，2014，22(8)：739-47.

10Sharma A，Ray R，Rajeswari M.Over expression of high mobility group (HMG) B1 and B2 proteins directly correlates with the progression of squamous cell carcinoma in skin〔J〕.Cancer Invest，2008；26(8)：843-51.

11Meng Q，Zhao J，Liu H，etal.HMGB1 promotes cellular proliferation and invasion，suppresses cellular apoptosis in osteosarcoma〔J〕.Tumour Biol，2014；35(12)：12265-74.

12Limana F，Esposito G，Fasanaro P，etal.Transcriptional profiling of hmgb1-induced myocardial repair identifies a key role for nootch signaling〔J〕.Mol Ther，2013；21(10)：1841-51.

13Bassi R，Giussani P，Anelli V，etal.HMGB1 as an autocrine stimulusin human T98G glioblastoma cells：role in cell growth and migration〔J〕.J Neurooncol，2008；87(1)：23-33.

14Kang R，Tang D，Schapiro N，etal.The HMGB1/RAGE inflammatory pathway promotes pancreatic tumor growth by regulating mitochondrial bioenergetics〔J〕.Oncogene，2014；33(5)：567-77.

〔2015-10-27修回〕

(编辑郭菁)

河南省科技厅科技攻关项目(112102310173)

张元峰(1973-)，男，硕士，副主任医师，主要从事脑瘤研究。

R739.41

A

1005-9202(2016)18-4500-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.047

1南阳市中心医院神经内科