子痫前期相关miRNAs的研究进展

严欢，张殊，林其德

产科生理及产科疾病

子痫前期相关miRNAs的研究进展

严欢，张殊△，林其德△

子痫前期是妊娠特异性疾病，是孕妇和新生儿死亡的主要原因之一，但是目前发病机制尚不清楚。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类具有组织特异性、发育阶段特异性和疾病特异性表达的非编码小RNA，含有21～25个核苷酸，参与基因转录后水平的调控。miRNA在维持胎盘的正常发育中发挥着重要作用，其异常表达常导致胎盘发育不良，进而导致妊娠相关疾病的发生。子痫前期患者的胎盘和血清中可检测到一些差异性表达的miRNA，这些miRNA的靶基因直接参与了子痫前期的发生和发展。从miRNA的角度在胎盘基因水平上揭示子痫前期的发病机制是目前研究的热点。miRNA有望成为子痫前期预测和监测的生物标记物及其治疗的靶点。现对表达于胎盘，特别是与子痫前期相关的miRNA及其靶基因功能的研究进展进行综述。

先兆子痫；微RNAs；妊娠；胎盘；基因；诊断

【Abstract】Pre-eclampsia is a disorder specific to human pregnancy，which is one of the main reasons for the death of pregnant women and newborns，but the pathogenesis is still unclear.MicroRNAs（miRNAs）are a class of non-coding small RNAs，expressed in a tissue-specific，developmental stage-specific and disease-specific manner.They are 21-25 nucleotides in length and regulate gene expression at post-transcriptional level.MicroRNAs play important roles in maintaining the normal development of the placenta，so the aberrant miRNAs expression often leads to poor placental development，resulting in the occurrence of pregnancy complications.Several miRNAs are differentially expressed in the placental tissue and serum of pregnant women，who later developed into pre-eclampsia and the target genes of these miRNAs are directly involved in the development of pre-eclampsia.It has been a hot topic to explore the pathogenesis of pre-eclampsia from the perspective of miRNAs.MicroRNAs are expected to be prediction and monitoring biomarkers and therapeutic targets for pre-eclampsia.Here，we summarized the research progress on miRNAs expressed in placenta，especially pre-eclampsia related miRNAs and their target genes.

【Keywords】Pre-eclampsia；MicroRNAs；Pregnancy；Placenta；Genes；Diagnosis （J Int Obstet Gynecol，2016，43：377-380，398）

子痫前期（pre-eclampsia，PE）是妊娠特异性疾病，表现为妊娠20周及以后新发的高血压（收缩压≥160 mmHg和（或）舒张压≥90 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa）和蛋白尿（24 h尿蛋白≥300 mg）［1］。PE的发病率约为5％～8％，是孕妇和新生儿死亡的主要原因之一。子宫螺旋动脉重塑不良、胎盘缺氧、系统性炎症反应和靶器官内皮功能障碍是PE发病中的关键阶段。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类含有21～25个核苷酸的非编码小RNA，参与基因转录后水平的调控。1993年，Lee等［2］在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中首次发现了miRNA，目前为止在人体中发现的miRNA已超过1 000种。据估计，miRNA调控人类将近30％的基因表达，参与细胞分化、增殖、迁移和凋亡等在内的所有生命过程。胎盘组织特异性地表达一群miRNA，同时PE胎盘中也发现了许多差异性表达的miRNA［3］。功能学研究表明，miRNA是调节胎盘发育和功能发挥的重要途径。然而，miRNA在PE胎盘中的调控机制尚不清楚。现综述与人类胎盘发育及PE相关的miRNA及其靶基因的功能。

1　miRNA简介

在哺乳动物中，miRNA的合成在细胞质和细胞核中进行。在细胞核中，编码miRNA的基因首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下，产生初始miRNA（primiRNA）。然后，在核糖核酸酶Ⅲ（RNaseⅢ）家族的Drosha核酸酶及迪乔治综合征危象区基因 8 （DGCR8）组成的微剪辑复合体作用下，pri-miRNA被剪切成长度为60～70个核苷酸、具有茎环结构的前体miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA被GTP结合的小G蛋白Ran（Ran-GTP）依赖的核输出受体5 （exportin-5）特异性识别后从细胞核运送到细胞质内。随后，pre-miRNA在胞质中被Dicer核酸酶切除末端茎环结构，形成双链miRNA复合体，其中只有一条链能行使成熟的miRNA的功能，另一条链则被降解。之后，成熟的miRNA链进入RNA诱导的基因沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）并参与形成非对称RISC复合物（asymmetric RISC assembly）。miRNA-RISC复合物与靶mRNA的3′非翻译区（3′-UTR）上的同源序列部分或完全结合，阻碍翻译的继续或引起靶mRNA降解［4］。

一个miRNA可以调控多个基因的表达，一个基因也可被多个miRNA调控。miRNA主要下调基因的表达，但也有文献报道miRNA可以正向调节基因的表达，例如，miR-373与E钙黏附蛋白（E-cadherin）和冷休克结构域蛋白C2的启动子结合，从而诱导这2种蛋白的表达［5］。

2　胎盘特异性miRNA

研究表明许多miRNA的表达具有组织特异性，尤其胎盘组织中的miRNA。研究者利用miRNA芯片和实时聚合酶链反应（PCR）的方法可以检测人类正常妊娠胎盘的miRNA表达谱，研究发现胎盘表达一群特异性的miRNA，这些miRNA可定位到相同的染色体基因集簇。通过对胎盘绒毛组织的小RNA文库测序也发现，这些在胎盘中特异性表达的miRNA几乎由 19号染色体 miRNA集簇（chromosome 19 microRNA cluster，c19mc）编码［6］。c19mc基因集簇是目前发现的最大的miRNA基因簇，其跨越人类染色体19q13.41约100 kb的核苷酸，包含46个固有的miRNA基因，可以产生58个成熟的miRNA［7］。c19mc基因集簇编码的miRNA涵盖了人胎盘原代滋养细胞（PHT）中高表达的绝大数miRNA［8］。Lee等［9］报道细胞中c19mc基因集簇上的miRNA如miR-525-3p、miR-517-5p和miR-517b-3p超高水平的表达（与人胚胎干细胞和胚胎癌细胞相比增高10～10 000倍）可以作为妊娠早期滋养细胞的特征和标志。另外，胎盘特异性miRNA的表达并不局限在滋养细胞，例如，miR-517a-3p、miR-519a-3p和miR-520c-3p也在胎盘来源的间质细胞中高表达［10］。尽管胎盘中c19mc基因簇的生物学功能尚未完全清楚，但可以确定的是其对维持胎盘正常发育有重要作用。

3　PE胎盘中差异性表达的miRNA

与正常妊娠的胎盘组织相比，PE胎盘中存在一群差异性表达的miRNA。Enquobahrie等［11］利用miRNA芯片和实时定量PCR检测了PE患者胎盘和正常妊娠胎盘组织（n=20）中差异性表达的miRNA，发现1个上调（miR-210），7个下调（miR-328、miR-584、miR-139-5p、miR-500、miR-1247、miR-34c-5p和miR-1）。Xu等［12］比较了重度PE和正常妊娠妇女胎盘中差异性表达的miRNA，发现7个上调（miR-210、miR-30a-3p、miR-518b、miR-524、miR-17-3p、miR-151和miR-193b），9个下调（miR-195、miR-223、miR-218、miR-17、miR-18a、miR-19b1、miR-92a1、miR-379和miR-411）。对比两者的测序结果可发现重叠的miRNA是miR-210，其在PE胎盘组织中高表达。Kleinrouweler等［13］的荟萃分析纳入了4项针对妊娠晚期妇女PE胎盘组织中差异性表达的miRNA的测序结果，进而在这些结果中挑选出有2篇及以上文献报道变化一致的miRNA，共有17个，其中miR-210有3篇文献报道上调，miR-126和miR-584有3篇文献报道下调，其他变化一致的miRNA有miR-1、miR-139-5p、miR-150、miR-181a、miR-542-3p、miR-625和miR-638。另外，Betoni等［14］将其关于PE差异性表达的miRNA芯片结果与8篇文献报道的结果进行对比，挑选出至少有1篇文献与其报道结果一致的miRNA，在138个miRNA中发现只有20个变化一致，即miR-1、miR-101、miR-126、miR-141、miR-145、miR-181a、miR-182、miR-193b、miR-210、miR-218、miR-223、miR-224、miR-29c、miR-30d、miR-363、miR-451、miR-517c、miR-518b、miR-519e和miR-542-3p。

由于使用的miRNA芯片种类、芯片囊括的miRNA数目、疾病的严重程度、孕龄、样品处理和数据分析方法等的差异，这些研究报道的PE相关miRNA只有少数重叠。从以上结果可以看出最常见的PE差异性表达的miRNA是miR-210，已知胎盘缺氧对PE的发生、发展起调节作用［15］，而低氧培养可上调滋养细胞miRNA-210的表达［16］，从而证实了miR-210与PE的关系密切。

4　循环miRNA与PE的早期诊断

PE的病理发生从妊娠早期就已开始，如果能在早期预测PE并对妊娠进行积极处理，可以避免许多妊娠不良事件的发生，因此寻找PE的早期诊断标志物尤为关键。从诊断的角度来看，检测患者血样中的特异性标志物是最简单易行的。研究已发现很多具有PE早期诊断价值的血清可溶性分子，如可溶性血管内皮生长因子受体1（sFlt1）、妊娠相关血浆蛋白A （PAPP-A）、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）和胎盘蛋白13（PP13）等，但是均缺乏较高的敏感度和特异度。近年来循环miRNA的检测已成为多种疾病早期诊断的分子标志物。Wu等［17］利用基因芯片技术检测了妊娠37～40周内发病的PE患者和正常妊娠女性的血清miRNA谱，比较后得出15个差异性表达的miRNA，利用逆转录PCR（RTPCR）验证后得出7个有显著性差异的miRNA，即miR-24、miR-26a、miR-103、miR-130b、miR-181a、miR-342-3p和miR-574-5p。Li等［18］的测序结果显示PE的母体血浆中有51种差异性表达的miRNA，利用RT-PCR技术在更多的样本中验证测序结果的可靠性，最终发现miR-141和miR-29a在轻度PE中高表达，miR-144在轻度和重度PE中表达下调。Miura等［19］也发现妊娠27～34周的重度PE患者血循环中存在c19mc基因簇中某些miRNA的高表达。前文已阐述miR-210在PE患者胎盘中高表达，Anton等［20］证实PE患者血清中也存在miR-210的高表达，其中的病例对照研究揭示miR-210的表达与PE的发生显著相关，前瞻性队列研究显示miR-210可以很早地预测PE的发生，其诊断时间比临床诊断时间提前几个月，因此血清miR-210检测是预测PE的良好标志物。

为寻找更早期的诊断标志物，Ura等［21］检测并分析重度PE妇女（n=24）在妊娠早期（12～14周）血浆中差异性表达的miRNA，结果显示12个miRNA表达上调（miR-1233、miR-650、miR-520a、miR-215、miR-210、miR-25、miR-518b、miR-193a-3p、miR-32、miR-204、miR-296-5p和miR-152），7个miRNA表达下调；进而用实时定量PCR验证测序结果得出差异性最明显的miRNA是miR-1233。以上报道的分子标志物，不论是蛋白分子还是某些miRNA，检测时间都在妊娠10周以后，这时错过了对妊娠进行预防性处理的最佳时间窗。因此，Winger等［22］报道了妊娠10周前［胚胎种植后（34.9±19.2）d］对母体循环血细胞中某些特定miRNA（如miR-132、miR-33a、miR-153、miR-545、miR-32、miR-1537）的定量检测可以准确预测妊娠晚期PE的发生，这些miRNA有望成为目前能够最早预测PE发病的分子标志物，其简单、易行、敏感度高。

5　PE相关miRNA的靶基因功能

miRNA在胎盘的发生发展中起着关键作用，Forbes等［23］通过小干扰RNA敲除Dicer核酸酶，使得孕早期细胞滋养细胞中miRNA整体减少，导致胎盘移植物中细胞滋养细胞的增殖显著增加，这说明miRNA在滋养细胞中主要起着负性调节作用。利用已建株的滋养细胞系和原代滋养细胞培养模型进行功能学的研究显示，miRNA在调控胎盘发育、血管生成及母胎免疫耐受中发挥着重要作用。

PE的发病机制涉及滋养细胞的增殖、迁移和侵袭能力不足导致的间质浸润过浅和子宫螺旋动脉的重塑不良。而很多PE相关miRNA的靶基因与细胞的增殖和侵袭有关。基质金属蛋白酶（MMP）家族是降解细胞外基质、促进细胞侵袭的重要调节者。Yu等［24］发现在PE胎盘中高表达的miR-204通过靶向干扰MMP-9的表达，抑制了滋养细胞的侵袭浸润。转化生长因子β（TGF-β）超家族在胚胎的发育、分化中起着重要作用，该超家族中的许多成员如激活素A（activin A）和Nodal在PE的胎盘中高表达，activin A和Nodal与两者的受体ⅡA型激活素受体（ActRⅡA）相互作用抑制滋养细胞的分化和侵袭，并诱导其凋亡。miR-195在PE中表达下调，在人绒毛滋养层细胞（HTR-8/SV-neo细胞）中证实了过表达miR-195可通过下调其靶基因——ActRⅡA的表达促进滋养细胞的侵袭［25］。

目前对miR-210的研究是最多的，PE患者的胎盘组织和血清中均能检测到miR-210的高表达。已证明miR-210是细胞在低氧环境中的表达产物之一，其在进化上很保守，普遍表达于不同类型的细胞，可特异性地被缺氧诱导因子1α（HIF-1α）所诱导。Kopriva等［26］报道活化的Toll样受体3（TLR3）可以通过HIF-1α和核因子κB p50蛋白（NF-κB p50）诱导miR-210的表达，进而靶向抑制白细胞介素4/信号转导与转录激活因子6（IL-4/STAT6）炎症信号通路，参与PE的发生、发展。另有研究发现miR-210通过靶向硫酸簇组装支架蛋白（ISCU）干扰滋养细胞的铁代谢［27］，ISCU位于线粒体内膜上，可以聚集线粒体上的硫酸铁并促进电子传递，参与氧化还原反应，与许多细胞生理功能有关。Zhang等［16］发现低氧可诱导miR-210的表达，进而下调产生促红细胞生成素的肝细胞受体（Eph受体）的配体ephrin-A3和同源盒基因A9（HOXA9）的表达，两者与滋养细胞的迁移、侵袭及血管重塑有关。有研究还发现miR-210的靶基因之一是钾离子通道调节因子1（KCMF1），miR-210通过干扰KCMF1的表达来抑制滋养细胞的侵袭［28］。这些结果提示miR-210在胎盘发育中的重要调控作用。

miR-17家族（miR-17、miR-20a和miR-20b）属于miR-17-92集簇，是PE相关miRNA，在血管生成中发挥着重要作用［29］。使用靶基因预测数据库进行生物信息学分析发现，miR-17家族有许多靶基因包括HIF-1α、IL-8、组织金属蛋白酶组织抑制剂2、MMP-2、血管内皮生长因子A（VEGFA）、ephrin-B2 （EFNB2）和Eph受体B4（EPHB4）。EFNB2和EPHB4分别是动脉和静脉的分子标志，属于ephrin配体和Eph受体酪氨酸激酶家族，它们在胎盘早期形成过程中介导细胞滋养细胞向EFNB2表达的子宫螺旋动脉而不是EPHB4表达的子宫静脉侵袭，进而参与子宫螺旋动脉的重塑［30］。而PE胎盘中高表达的 miR-17家族成员可能通过抑制 EFNB2和EPHB4的表达，从而抑制细胞滋养细胞的血管内转化及血管内滋养细胞向螺旋动脉的侵袭，进一步导致螺旋动脉重塑失败，母胎界面血流量减少，最终导致PE［31］。

6　结语

综上，PE的发病机制尚未明确，目前认为其发生涉及胎盘氧化应激、炎症反应、免疫适应不良和信号通路改变等诸多领域，而miRNA可参与其中任何一个环节。测序技术的发展使得从PE胎盘组织和血浆中检测差异性表达的miRNA的研究得到快速发展，鉴定新的miRNA、确定其靶基因并明确其功能是PE发病机制研究的重要方向。如果能在妊娠中期甚至是妊娠早期筛查出PE的高危孕妇，进而对其进行干预，对降低孕妇和新生儿死亡率意义重大。未来期待针对PE相关miRNA建立一套系统规范的检测流程，为其早期诊断提供有效的帮助。因此，PE相关miRNA有望成为疾病预测、监测标志物及治疗的靶点，是PE转化医学研究的主要突破点之一。

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［本文编辑秦娟］

Research Progress of microRNAs in Pre-eclampsia

YAN Huan，ZHANG Shu，LIN Qi-de.Department of Obstetrics and Gynecology，Renji Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai Key Laboratory of Gynecologic Oncology，Shanghai 200127，China.

LIN Qi-de，E-mail：linqidesh@126.com；ZHANG Shu，E-mail：drzhangshu@126.com

·综述·

200127上海交通大学医学院附属仁济医院妇产科，上海市妇科肿瘤重点实验室

林其德，E-mail：linqidesh@126.com；张殊，E-mail：drzhangshu@ 126.com

△审校者

2016-03-23）