微小RNAs在宫颈癌中的异常表达分析

屈建花，曹文君，苗聪秀

·综述·

微小RNAs在宫颈癌中的异常表达分析

屈建花，曹文君，苗聪秀△

微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是现今肿瘤学研究的热点，与包括宫颈癌在内的多种恶性肿瘤的发生、发展、侵袭、转移密切有关，有关miRNAs与宫颈癌关系的研究日益增多。研究发现，有些机制能引起miRNAs异常表达，且异常表达的miRNAs通过影响重要的调节基因促进宫颈癌的发生，在宫颈肿瘤的恶性转化过程中有重要作用。本文就宫颈癌中miRNAs异常表达的可能机制及其在宫颈癌不同生物学阶段的作用进行综述。

微RNAs；基因表达；宫颈肿瘤；癌

【Abstract】MicroRNAs（miRNAs）have become the center of interest in oncology and are closely associated with a variety of tumors including the occurrence，development，invasion and metastasis of cervical cancer.Great concern has been raised regarding the correlation between cervical cancer and miRNAs.Studies demonstrated that some mechanisms could cause aberrant expressions of miRNAs.MiRNAs regulate gene expression by influencing important regulatory genes and thus are responsible for causing cervical cancer which plays a key role in malignant transformation of cervical cancer.In this paper，the pathogenesis of miRNAs dysregulation in different stages of cervical cancer are reviewed.

【Keywords】MicroRNAs；Gene expression；Uterine cervical neoplasms；Carcinoma （J Int Obstet Gynecol，2016，43：424-427）

微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一种长约17～22个核苷酸的非编码单链RNA，1993年首次由Lee等从秀丽隐杆线虫中发现。miRNAs通过切割mRNA和抑制mRNA翻译来调控基因表达，在人类发展中起重要作用［1］。研究表明，miRNAs的异常表达与宫颈癌的发生、发展及预后有密切关系，染色体的异常改变、DNA甲基化、miRNAs或其结合位点多态性、转录因子异常调控可能导致miRNAs异常改变，从而影响原癌基因或抑癌基因，改变宫颈癌细胞生长、侵袭及转移潜能。约1％～2％的人类基因编码miRNAs。成熟的miRNAs来源于miRNAs前体（primiRNAs），编码该前体的序列可能位于核DNA的不同部位，组成单或多顺反子转录单位，也可能位于内含子、外显子或编码蛋白基因。

宫颈癌由宫颈上皮内瘤变发展而来，病理类型主要为鳞状细胞癌（75％～85％）、腺癌（20％～25％）和腺鳞癌（3％～5％），几乎所有流行病学资料结合实验室的数据都强有力地支持高危型人乳头瘤病毒（HPV）持续感染是宫颈癌发生的必要条件。近年来宫颈癌中异常表达的miRNAs，靶基因预测，作用机制及其在宫颈癌起始、发生、发展不同阶段的作用备受关注。

1　宫颈癌中miRNAs异常表达的可能机制

一些机制能引起miRNAs的表达异常，而这些异常又会进一步导致包括肿瘤在内的疾病发生。导致miRNAs异常表达的原因包括miRNAs位点删除或扩增、DNA甲基化、miRNAs及miRNAs靶位点多态性、转录因子异常调控。

1.1宫颈癌中miRNA位点删除或扩增转录miRNAs的基因常位于断裂点区、杂合性丢失（LOH）最小区和脆性位点。因此，染色体改变被认为是恶性肿瘤中引起miRNAs异常表达的主要原因。LOH在包括宫颈癌在内的多种恶性肿瘤的早期发展过程中十分普遍。在宫颈癌中位于11q24.1的miR-100表达水平下调，11q23.3～11q24.1区域与LOH有关，推测LOH可能导致miR-100表达水平下调。肿瘤形成过程中基因活化的其他机制有染色体获得和扩增。例如宫颈癌组织特异表达的miR-944位于宫颈癌中经常被扩增的染色体片段3q27～28。研究发现miR-9（1q23.2）、miR-15b（3q25.32）、miR-28-5p （3q27.3）、miR-100、miR-125b（11q24.1） 这 5种miRNAs与染色体改变有关，进一步分析发现染色体1q突变可能与miR-9的上调有关。宫颈癌中Drosha的高表达会影响整体miRNAs的表达，染色体5p突变与miRNA处理酶Drosha的高表达及miRNA的表达谱有关。Drosha过表达被认为是宫颈癌后期进展的主要机制之一，即过表达的Drosha会增加成熟miRNAs的表达水平，而这反过来又会影响mRNA的转录和其他pri-miRNAs的产物。

1.2宫颈癌中miRNA表观遗传调控DNA甲基化是一种表观遗传修饰，抑制基因表达，进而改变其表型。研究发现，表观遗传改变参与宫颈癌形成。Wilting等［2］发现，在宫颈癌组织中，miR-203、miR-375的CpG岛甲基化明显，而miR-203、miR-375的表达下调，进一步添加去甲基化试剂可使miRNAs表达复活，提示miR-203、miR-375的CpG岛高甲基化是miR-203、miR-375下调的主要机制。Campos-Viguri等［3］用5-氮杂-2′-脱氧胞苷处理HeLa、SiHa、CaSki和C33A细胞，使miR-23b启动子区甲基化，结果发现miR-23b的表达升高，表明miR-23b的表达水平受其启动子甲基化调控。由HPV导致宫颈恶变过程中的不同时期，甲基化水平的miR-149、miR-203、miR-375的表达增加。在宫颈癌细胞系发现，多种miRNAs的甲基化（如miR-432、miR-1286、miR-641、miR-1290、miR-1287、miR-95）与HPV感染有关。因此，异常的DNA甲基化在宫颈癌中调控miRNA表达有重要作用。

1.3宫颈癌中miRNAs及miRNAs靶位点多态性研究表明，编码蛋白或miRNAs的基因或miRNAs靶向基因的单核苷酸多态性（SNP）会改变miRNAs的表达和（或）成熟，而此与恶性肿瘤生长有关。PrimiR-218（rs11134527）的多态性导致miR-218的表达改变，进而影响miRNA结合过程，从而增加宫颈癌的易感性［4］。hsa-miR-499（rs3746444A/G）和hsamiR-146a（rs2910164G/C）的多态性与宫颈鳞癌有关。miR-146a（rs2910164）通过提高成熟miR-146a的表达水平来影响中国人群对宫颈癌的基因易感性。Meta分析发现，miR-124（rs531564C＞G）的多态性，是中国人群对包括宫颈癌在内众多恶性肿瘤的危险因素，多项研究则发现，miR-124多态性与其基因多态性有关［5］。miRNAs靶向结合位点多态性也会改变罹患宫颈癌的风险。研究发现Bcl-2的miRNA靶向结合位点C到T的多态性与宫颈肿瘤的形成有关。Pri-miR-218（rs11134527，A/G） 和 LAMB3 （rs2566，C/T）的多态性分别会减少或增加宫颈癌的发病率。SNP与宫颈癌的关系及可能的生物机制尚需进一步研究来阐明。

1.4宫颈癌中miRNAs的转录因子调控基因表达受转录因子和靶基因上游调控元件的调控［6］。转录因子作为miRNA调节因子，可激活或抑制miRNA表达。转录因子活动改变会导致miRNA表达改变。Mao等［7］研究发现，转录因子KLF4（Krueppel-like factor 4）激活miR-544启动子区，从而上调宫颈癌miR-544表达水平。目前转录因子调控miRNAs表达的研究较少。

2　宫颈癌不同生物学阶段miRNAs的作用

研究表明，miRNAs在凋亡、细胞周期、侵袭和转移的生理学过程中发挥不同作用。

2.1凋亡凋亡在正常生理过程和宫颈组织中有重要作用。2003年首次报道miR-14在果蝇中调控凋亡。凋亡受多种蛋白调控。Bcl-2家族由多种蛋白组成，是凋亡途径中的重要因子，可分为3个功能组，Ⅰ组由Bcl-2和Bcl-xL组成，起抗凋亡作用；Ⅱ组由Bax和Bak组成，起促凋亡作用；Ⅲ组由Bim和Bad组成，也起促凋亡作用。Liu等［8］发现miR-143过表达会促进凋亡，抑制HeLa细胞生长，而抗miR-143将会解除这一效应。miR-143抑制携带Bcl-2的3′-非翻译区（3′-UTR）的荧光素酶报告基因活动，一旦miR-143靶向结合位点突变，这一抑制效应也会消失，说明Bcl-2是miR-143的靶基因，miR-143通过间接靶向作用于Bcl-2来抗凋亡，是一个抗凋亡因子。miR-886-5p在宫颈癌中上调，靶向作用于Bax蛋白。Bax和（或）Bak蛋白破坏线粒体外膜，致细胞色素释放，激活caspase（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶），激活的caspase-9导致细胞最终死亡。

宫颈癌中最被认可的抑制凋亡途径是蛋白激酶B（AKT）信号通路。有研究报道，miR-218通过抑制AKT-mTOR信号通路来抑制宫颈癌细胞生长，同时还会减少HeLa细胞中Rictor和磷酸化AKT水平［9］。因此推测miR-218靶向作用于mTOR成分Rictor后，阻断AKT磷酸化。Cong等［10］发现miR-634在宫颈癌组织中表达异常增加，证实miR-634可靶向结合mTOR mRNA 3′-UTR，负性调控mTOR基因表达，诱导宫颈癌细胞凋亡。

2.2细胞周期调控正常细胞生长受细胞周期蛋白的调控，调控失常会导致细胞无限生长而发展为恶性肿瘤。周期蛋白依赖性激酶（CDK）途径在细胞周期调控中起主要作用，宫颈癌中此途径受多种miRNAs调控。miR-29a与CDK6呈负相关。CDK6在G1期呈活化状态，且活性依赖于细胞周期蛋白D1 （cyclinD1）。G1向S期转化前期，cyclinD1水平升高。miR-29a低表达导致cyclinD1和CDK6转录物高表达，形成大量cyclinD1/CDK6复合物，进而导致Rb不受限制的磷酸化，从而使细胞无限增殖形成恶性肿瘤。Wang等［11］发现，miR-195在早期宫颈癌组织呈低表达，miR-195可靶向作用于cyclinD1a mRNA 的3′-UTR来调控cyclinD1表达水平，抑制癌细胞增殖。miR-214间接靶向作用于cyclinD1。研究发现宫颈癌中miR-214下调，其靶向作用于c-Jun氨基端激酶1（JNK1）的3′-UTR。JNK1靶向作用于调控增殖的活化蛋白转录因子组成员，进而调控包括增殖在内的多种生物活动。活化的JNK1诱导c-Myc，而c-Myc能抑制p21表达，通过cyclinD1表达来促进细胞增殖。JNK1也可下调c-Jun，而c-Jun则抑制p53表达。miR-372通过靶向作用于 CDK2和cyclinA1来控制细胞周期。CyclinA1先与CDK2结合，促使DNA复制，随后再与CDK1结合促进有丝分裂。

p53是一种肿瘤抑制蛋白，在调控细胞增殖中起重要作用。YY1（Yin Yang 1）属于锌指结构的一种转录因子，调控细胞生长及分化，在人类多种恶性肿瘤中起致癌基因作用。由YY1、MDM-2、p53组成的三元复合物将p53运输到蛋白酶体，p53在此被降解。YY1过表达将会导致p53水平降低。Zhou等［12］发现在宫颈癌中miR-181与YY1的表达呈负相关，miR-181可靶向作用于YY1抑制肿瘤生长。

在癌细胞中，有丝分裂激酶的过表达会忽略检测点。PLK1（pole like kinase 1）是G2/M转化期一个重要的检测点，在宫颈癌中miR-100靶向作用于PLK1。PLK1过表达会导致cyclinB1和Cdc25C过度活化，使细胞进入有丝分裂期。Xu等［13］发现在宫颈癌中，细胞周期检测点激酶1（Chk1）和p-Chk1的表达水平与miR-424呈负相关，过表达的miR-424会抑制Chk1，而RNA干扰介导的Chk1敲除会减少基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达。

叉头框蛋白O1（FOXO1）是叉头转录因子家族的重要组成部分。细胞中未磷酸化的活性形式FOXO1在细胞中表达增加，这与CDK抑制剂p27Kip1和p21Cip1的下调、转录和翻译水平cyclinD1上调有关。宫颈癌细胞中，miR-223和miR-182直接作用于FOXO1，使得其表达下调［14］。miR-302-367下调cyclinD1和AKT1，上调p27Kip1和p21Cip1，进而抑制宫颈癌细胞的生长［15］。Xu等［16］通过生物信息学分析发现miR-135的下游靶目标是FOXO1，miR-135在宫颈癌细胞系中高表达，对宫颈癌细胞进行转染，使miR-135表达下降，其FOXO1的表达水平也相应下调，宫颈癌细胞的增殖部分受到抑制，提示miR-135通过靶向作用于FOXO1，从而促进宫颈癌细胞生长。Hou等［17］发现，miR-196a在宫颈癌组织及细胞系中呈高表达，通过生物信息学和生物学方法证实miR-196a可靶向作用于FOXO1和p27Kip1，调控磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT信号通路，促进宫颈癌细胞增殖。

2.3宫颈癌转移宫颈癌转移，需突破上皮基底膜，此过程被称为上皮间质转化（EMT）。研究表明miRNAs参与宫颈癌的转移过程。在宫颈癌组织中，miR-205通过EMT来抑制细胞转移/侵袭［18］。富半胱氨酸蛋白（CYR61）和结缔组织生长因子（CTGF）蛋白通过与细胞表面受体（如整合素蛋白受体和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）的相互作用在细胞增殖、黏附、转移、血管生成和肿瘤形成中起重要作用。miR-205可靶向作用于CYR61和CTGF蛋白。miR-155的下调与宫颈癌的转移/侵袭有关，miR-155抑制细胞信号转导分子Smad2的表达，负性调控EMT，miR-155的过表达还会导致TP53的活化进而逆转EMT。汤雅玲等［19］通过对50例宫颈癌患者肿瘤组织内miRNA-200c、ZEB1（宫颈癌EMT相关因子）水平进行分析，发现两者表达水平呈负相关，提示EMT在宫颈癌的浸润和转移过程中起重要作用，而miRNA-200c可能对EMT起调节作用。

在侵袭过程中，MMPs在降解细胞外基质中起重要作用。细胞外基质是组织细胞外部分，介导细胞黏附。尿激酶纤溶酶原激活物（uPA）是一种丝氨酸蛋白酶，能将纤溶酶原激活为纤溶酶，同时也能激活MMPs，这使癌细胞能降解细胞周围蛋白。HPV-16 E6蛋白能够下调miR-23b，这会增加uPA的表达，从而诱导人类宫颈癌细胞的转移。

其他研究发现，异常的糖基化作用在肿瘤的转化、侵袭、转移过程中起重要作用。miR-214在宫颈癌中表达下调。在糖基化作用中，N-乙酰半乳糖胺基转移酶7（GALNT7）起催化作用，miR-214能够靶向作用于GALNT7并抑制其表达来抑制宫颈细胞的生长［20］。宫颈腺癌中，LAMB3促进宫颈癌细胞的转移和侵袭。Yamamoto等［21］发现，miR-218下调将会减少LAMB3的表达。Laminin-332是一个由 3条链（LAMA3，LAMB3，LAMC2）组成的异三聚体，在再生和修复过程中调控细胞转移。宫颈病变中，Laminin-332能够与许多细胞表面受体结合，被视为一种侵袭性标志。整合素是一种跨膜蛋白，能够介导细胞内外的信号通路的转导，从而调控癌细胞的细胞周期、细胞转移、侵袭。

血管生成是恶性肿瘤转移中一个必要的过程。血管生成因子如血管内皮生长因子（VEGF）可促进血管生成。Sp1将丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径与VEGF表达偶联起来。研究发现miR-375靶向作用于SP1的3′-UTR来敲除SP1进而减少细胞转移和侵袭性。上调的miR-375在宫颈癌中通过阻断G1到S期的转化来抑制细胞增殖。VEGF在血管生成方面起重要作用，研究发现许多恶性肿瘤中，多种miRNAs的直接靶作用点是VEGF。尚需进一步研究阐明宫颈癌中miRNA靶向作用或参与VEGF介导的血管生成机制。

3　结语

众多miRNAs被证实在肿瘤发生、发展过程中发挥着重要作用，并有望成为肿瘤相关的分子标记物和肿瘤治疗的新靶点。近年来对于内源性小分子RNA的研究已取得令人瞩目的成果，miRNAs血清监测的简便性及无创性，在肿瘤的筛查、诊断、治疗及预后评估等多方面都有着广阔的应用前景，为宫颈癌的诊疗提供了新思路。文献报道与宫颈癌有关的miRNAs有200余种，确定的靶基因有40余种，miRNAs在宫颈癌的发生、发展中影响各种不同的信号通路，这些机制的阐明能够为宫颈癌的早期诊断、早期治疗、判断预后提供可靠的理论依据。相信随着研究的进一步深入，miRNAs这一新兴的分子标记物将对宫颈癌的早期诊断、防治起到重要的促进作用。

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［本文编辑王昕］

The Analysis of Dysregulated miRNAs Involved in Cervical Cancer

QU Jian-hua，CAO Wen-jun，MIAO Cong-xiu.Changzhi Medical College，Changzhi 046000，Shanxi Province，China

MIAO Cong-xiu，E-mail：lbmcxsz@163.com

山西省青年科技研究基金面上项目（2015021185）；长治医学院科技创新团队项目（CX201403）

046000长治医学院

苗聪秀，E-mail：lbmcxsz@163.com

△审校者

2015-12-28）