加减驻景方含药血清对CoCl2诱导ARPE-19细胞表达VEGF及HIF-1α的影响

高 娜，亢泽峰，褚文丽，陶方方

·论著：实验研究·

加减驻景方含药血清对CoCl2诱导ARPE-19细胞表达VEGF及HIF-1α的影响

高 娜1，亢泽峰2，褚文丽2，陶方方2

目的探讨加减驻景方含药血清对二氯化钴（CoCl2）诱导后人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19细胞系）中血管内皮生长因子（VEGF）及缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）蛋白表达的影响。方法1.体外培养ARPE-19细胞，取对数生长良好的细胞用于实验，分为正常组，缺氧模型组，阳性对照组、含药血清组，并设立不同时间点。2.酶联免疫吸附试验（ELISA）观察CoCl2诱导后不同时间、各组细胞上清液中HIF-1α的表达。3.蛋白质印迹法（Western blot）观察CoCl2诱导后不同时间、各组细胞中VEGF、HIF-1α的表达情况。结果缺氧损伤后可诱导ARPE-19细胞中VEGF、HIF-1α蛋白的表达增加；与正常组比较，缺氧模型组VEGF及HIF-1α的表达高于正常组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；含药血清组与模型组比较，VEGF及HIF-1α的表达低于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论加减驻景方含药血清对缺氧损伤后ARPE-19细胞中VEGF、HIF-1α蛋白的表达有抑制作用。

加减驻景方；视网膜色素上皮细胞；血管内皮生长因子；低氧诱导因子

研究表明脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）的发生中，由于炎症及缺氧致局部微环境的改变，导致视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）增加，促进了CNV的发生[1]。其中缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1α）相关信号转导通路是脉络膜新生血管形成过程中的重要通路之一，是调控VEGF高表达的主要信号通路。我们在前期临床观察及动物实验的研究中发现，中药加减驻景方能促进黄斑出血的吸收，提高视力，改善视功能，并能抑制CNV的产生[2-4]。在进一步对ARPE-19细胞缺氧模型的研究中发现，加减驻景方含药血清能抑制ARPE-19细胞的增殖。为了进一步探讨加减驻景方含药血清是如何调控VEGF的表达及抑制CNV形成的机制，本实验观察了加减驻景方含药血清对CoCl2诱导的ARPE-19细胞表达VEGF及HIF-1α蛋白的影响，为临床中医治疗CNV提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞

正常健康SD大鼠20只[北京市维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK（京）2012-0001]，体质量150～170 g，雄性。在动物房适应生活1周后开始实验。所有动物饲养于中国中医科学院眼科医院实验动物中心屏障级动物房内，恒温恒湿，普通饮食及饮水喂养，循环光照（光照12 h，黑暗12 h），SPF饲养条件，温度（22±2）℃。ARPE-19细胞（购自广州吉妮欧生物科技有限公司，批号：ATCCRCRL-2302TM）。

1.2 主要药品、试剂及仪器

加减驻景方由楮实子、枸杞子、菟丝子、三七粉等组成（中药饮片由北京燕北药材公司提供，中药水煎液由中国中医科学院眼科医院煎药室制备）。康柏西普眼用注射液（成都康弘生物科技有限公司，批号：S20130012，10 mg/ml，0.2 ml/支）。

MEM培养液（Hyclon公司）；胎牛血清（GIBCO公司）；二氯化钴（北京化工公司）；人血管内皮生长因子酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；HIF-1α ELISA试剂盒（cloudclone corp）；蛋白定量（BCA法）试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）；抗HIF-1α抗体AB5382-100 μg（Millipore）；抗VEGF抗体ABS82-100 μg（Millipore）；RIPA裂解缓冲液（北京普利莱基因技术有限公司）；蛋白酶抑制剂混合物（北京普利莱基因技术有限公司）；电泳缓冲液（北京普利莱基因技术有限公司）；转膜缓冲液（北京普利莱基因技术有限公司）。

主要仪器设备：5%二氧化碳培养箱（Thermo electron corporation）；荧光倒置显微镜（Olympus，IX81）；4℃离心机（Germany）；电泳仪（BIO-RAD，USA）；紫外分光光度计（BIO-RAD，USA）；GE-ImageQuant-LAS-4000化学发光成像分析仪（GE Healthcare）。

1.3 含药血清的制备方法

正常健康SD大鼠20只，按奇偶数随机分成加减驻景方含药血清组和空白血清组，每组10只。含药血清组给予加减驻景方灌胃，灌胃体积均为20 ml/kg，每日2次，连续给药3 d。空白血清组给予等量的蒸馏水溶液。末次给药1 h后腹腔注射盐酸氯胺酮35 mg/kg与盐酸赛拉嗪5 mg/kg的混合液麻醉，无菌条件下腹主动脉采血，常温静置、离心、取上清液、灭菌、过滤除菌，-20℃保存备用。

1.4 ELISA法检测细胞上清液中HIF-1α蛋白

按常规细胞培养法培养ARPE-19细胞，取对数生长期良好的8代细胞用于实验。分为正常组，缺氧模型组（100 μmol/L，CoCl2），康柏西普阳性对照组（20 μg/ml康柏西普）、加减驻景方含药血清组（20%）。37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，24 h后弃培养液，加入不含胎牛血清的MEM继续培养12 h，再次弃培养液，根据分组不同，正常组加不含胎牛血清的MEM，其他各组分别加入含不同浓度药物的培养液，每个浓度、时间段各设6个复孔。各组分别培养24 h、48 h、72 h后，收集细胞培养上清液于离心管内，样品检测前存储于-80℃备用。按照人HIF-1α ELISA检测试剂盒说明进行检测。实验重复3次。

1.5 Western blot法检测细胞中VEGF及HIF-1α蛋白

细胞的培养、分组、干预方法同上述实验，采用细胞裂解提取细胞总蛋白，按BCA法测样本蛋白质浓度，按照Western blot实验步骤，以β-actin为内参，计算VEGF及HIF-1α蛋白的相对表达量。

1.6 统计学方法

应用SPSS17.0统计软件进行统计分析，计量资料以x±s表示，采用重复测量资料的方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA法检测HIF-1α蛋白的表达情况

各组ARPE-19细胞在不同培养时间细胞上清液中的HIF-1α含量的总体差异不同（重复测量资料的方差分析，F分组=147.839，P＜0.001；F时间=895.702，P＜0.001；F交互作用=3.215，P＜0.05），缺氧组HIF-1α水平明显高于正常组（P＜0.001），含药血清组、康柏西普阳性对照组的HIF-1α数值与正常组较为接近（P＞0.05）（表1，图1）。

表1 ELISA法检测各组ARPE-19细胞上清液中HIF-1α的含量（x±s）

图1 各组ARPE-19细胞在不同培养时间细胞上清液中HIF-1α含量的变化情况HIF-1α：缺氧诱导因子-1α

2.2 Western blot检测VEGF及HIF-1α蛋白的表达情况

各组ARPE-19细胞中VEGF表达的变化趋势比较接近（随培养时间延长逐渐增高），且不同组间以及不同时点之间均存在统计学意义的差异（重复测量资料的方差分析，F分组=18.261，P＜0.01；F时间= 113.018，P＜0.001；F交互作用=0.615，P=0.715）。模型组细胞中的VEGF含量高于其他三组（P＜0.001），而正常组、康柏西普组及含药血清组细胞中的VEGF水平整体上差异不大（表2，图2～图3）。

表2 Western blot法检测各组ARPE-19细胞中VEGF的相对表达量（x±s）

图2 Western blot法检测各组ARPE-19细胞中VEGF表达的电泳图。1～3、4～6、7～9、10～12分别为正常组、缺氧模型组、康柏西普阳性对照组、加减驻景方含药血清组在培养24 h、48 h、72 h时的结果VEGF：血管内皮生长因子

图3 Western blot法检测各组ARPE-19细胞在不同培养时间VEGF相对表达量（VEGF/β-actin）的变化情况VEGF：血管内皮生长因子

各组不同时间细胞中HIF-1α的变化情况与VEGF的变化相似，组间以及各时点间的总体差异均有统计学意义（重复测量资料的方差分析，F分组= 54.186，P＜0.001；F时间=355.808，P＜0.001；F交互作用= 1.210，P=0.355）。与VEGF类似，模型组细胞中HIF-1α表达水平明显高于其他三组（P＜0.001），而其他三组的HIF-1α水平十分接近（表3，图4～图5）。

表3 Western blot法检测各组ARPE-19细胞中HIF-1α的相对表达量（x±s）

图4 Western blot法检测各组ARPE-19细胞中HIF-1α表达的电泳图。1～3、4～6、7～9、10～12分别为正常组、缺氧模型组、康柏西普阳性对照组、加减驻景方含药血清组在培养24 h、48 h、72 h时的结果HIF-1α：缺氧诱导因子-1α

图5 Western blot法检测各组ARPE-19细胞在不同培养时间HIF-1α相对表达量（HIF-1α/β-actin）的变化情况HIF-1α：缺氧诱导因子-1α

3 讨论

研究表明，人类疾病和动物模型的CNV细胞成分主要由血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、周细胞、RPE和炎症细胞等组成，在CNV形成的不同阶段，RPE起着不同的作用。在新生血管形成的起始期和活动期缺血缺氧、氧化应激、衰老等因素可诱发RPE细胞分泌多种促血管生成因子，促进内皮细胞活化、增殖、迁移，导致CNV的形成；在退化期，RPE基底膜增厚，分泌的促血管生成因子下调，血管生成抑制因子上调，促使CNV退化。可见RPE细胞在CNV发生过程中起着双重调节作用。体外研究目前广泛采用细胞或组织培养，细胞培养简化了环境条件，排除了一些复杂因素的影响，具有简化性、针对性强等特点，其中的人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19是此类研究比较常用的细胞模型[5-6]。因此本实验体外培养ARPE-19细胞，采用二氯化钴模拟细胞缺氧，观察各处理因素对ARPE-19缺氧后细胞增殖活性的影响。康柏西普眼用注射液作为抗VEGF药物于2013年底在我国批准上市，用于治疗湿性年龄相关性黄斑病变[7]，该药是一种VEGF受体与人免疫球蛋白Fc段重组的融合蛋白，能特异性地结合VEGF，通过抑制VEGF及其受体的信号传递达到对新生血管的抑制，从而达到治疗相关新生血管性眼病[8-9]，因此选择以康柏西普为阳性对照组。

体外实验中血清药理的研究方法是重要环节，中药含药血清有着自身众多的优势，在细胞培养中，细胞所处的内环境与血清的理化性质基本相同，这很好地排除了制剂本身对实验结果的影响。中药含药血清在方法学上为中药及中药复方的研究提供了新的途径，排除了中药制剂的理化干扰，为药动学、药化学、中药及中药复方药理学提供了新的研究思路[10]。

本实验采用ELISA方法和Western blot方法分别检测了加减驻景方对低氧诱导的ARPE-19细胞上清液HIF-1α蛋白，以及ARPE-19细胞中VEGF和HIF-1α蛋白表达的影响。实验结果显示，模型组（100 μmol/L氯化钴）中VEGF、HIF-1α蛋白表达显著高于正常组，药物干预组（20%的加减驻景方含药血清组、20 μg/mL康柏西普阳性对照组）中VEGF、HIF-1α蛋白表达则显著低于模型组，说明20%的加减驻景方含药血清、20 μg/mL康柏西普均对VEGF、HIF-1α蛋白表达有抑制作用。在Western blot检测细胞内VEGF和HIF-1α水平的结果中,我们未能观察到组别因素对各指标随时间变化趋势的影响,考虑可能与样本量过小，实验设计等因素有关，我们将在后续实验中结合体内实验进一步研究细胞增殖与时间和药物的具体关系。

本实验是从缺血模型着手进行的中医药研究，下一步将试对加减驻景方治疗CNV的多靶点多通路作用机制进行探讨，为临床用药提供更多的实验依据。

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Effects of serum with modified Zhujing prescription on expression of VEGF and HIF-1α in cobalt chloride induced ARPE-19 cells

GAO Na,KANG Zefeng,CHU Wenli,et al.
The Second People's Hospital of Xining,Xining 810003,China

OBJECTIVE To explore effects of serum with modified Zhujing prescription on expression of vascular endothelium growth factor(VEGF)and hypoxia-inducible factor 1α(HIF-1α)protein in cobalt chloride induced ARPE-19 cells.METHODS 1.The ARPE-19 cells cultured in vitro and cells in well logarithmic growth were chosen to be assigned randomly into normal group,hypoxia group，positive control groups and medicated serum group.Time interventions were set for observation.2.Effects on expression of HIF-1α in supernate at different time point were assessed by ELISA.3.The expression of VEGF and HIF-1α protein in ARPE-19 cell under hypoxia were detected by Western Blot.RESULTS Expression of VEGF and HIF-1α increased after hypoxic injury,in addition, they were higher than counterparts of normal group.The difference was statistically significant(P<0.05).While compared with model group,expression of VEGF and HIF-1α in medicated serum group were higher statistically(P< 0.05).CONCLUSIONS Medicated serum with modified Zhujing prescription inhibited the expression of VEGF and HIF-1α in ARPE-19 cells under hypoxia injury.

modified Zhujing prescription;retinal pigment epithelium(RPE)cell;vascular endothelium growth factor(VEGF);hypoxia-inducible factor 1α(HIF-1α)

R285.5

A

1002-4379（2016）06-0351-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.06.001

国家自然科学基金面上项目（81574032）

1.青海省西宁市第二人民医院眼科，西宁810003 2.中国中医科学院眼科医院，北京100040

亢泽峰，E-mail：zefeng2531@163.com