胸腺肽α1对脓毒症大鼠心肌的保护作用＊

张　明，林钦汉，陈　军，温振杰，刘建凌



胸腺肽α1对脓毒症大鼠心肌的保护作用＊

张明，林钦汉，陈军，温振杰，刘建凌

[摘要]目的探讨胸腺肽α1对脓毒症大鼠心肌保护作用的可能机制。方法40只雄性SD大鼠随机分为4组，分别是对照组，假手术组，脓毒症组及胸腺肽治疗组。采用盲肠结扎穿刺法制造脓毒症模型，胸腺肽治疗组予胸腺肽干预，其他组予生理盐水对照。通过心脏彩超观察大鼠心功能变化，取心肌组织分别检测各组激活p38分裂原激活的蛋白激酶（p38 MAPK）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、一氧化氮（NO）水平，组织切片行HE染色观察组织形态。结果脓毒症组心肌细胞磷酸化的p38 MAPK表达水平较对照组及假手术组上调，TNF-α、NO水平增高。胸腺肽α1能抑制脓毒症大鼠心肌细胞磷酸化的p38 MAPK、TNF-α、NO水平的增高，改善心脏EF值。结论胸腺肽α1可能通过抑制p38 MAPK途径对脓毒症心肌损害具有一定的保护作用。

[关键词]胸腺肽α1；脓毒症；大鼠；心肌损害

脓毒症自20世纪70年代以来一直是医学领域的重点和难点，其发病率、病死率居高不下。脓毒症导致的心肌损害极其常见、影响巨大，往往直接加重患者病情。据统计，脓毒症合并心功能障碍使脓毒症患者病死率由不合并心功能障碍的30％增长到70％，其致病机制仍未明确，治疗、监测手段均极其匮乏[1]。

越来越多证据认为，脓毒症心肌损害的主要致病因素是过度的全身炎症反应造成的炎症因子的大量释放，激活p38分裂原激活的蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAPK），显著增加肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）的表达，TNF可直接或通过一氧化氮（nitric oxide，NO）间接抑制心肌细胞功能。因此针对某单一靶点的特异性治疗可能很难奏效，免疫调节治疗可能具有更大优势。胸腺肽α1作为主要的免疫调节药物之一，能降低血清中TNF-α的表达，减轻炎症反应，但至今未见该药物在脓毒症心肌损害中的相关研究。该研究主要评估胸腺肽α1对脓毒症大鼠心肌损害的保护作用。

1　材料与方法

1.1动物分组及模型制作成年雄性SD大鼠40只，体重180～220 g，其来源于广东省实验动物中心，生产许可证：粤SCXK 2013-0002。将其随机分为4组，分别是对照组（A组），假手术组（B组），脓毒症组（C组）及胸腺肽治疗组（D组）。大鼠适应环境后禁食12h。C组及D组大鼠通过盲肠结扎穿孔法制造脓毒症模型：采用水合氯醛予大鼠腹腔注射麻醉，在侧腹开切口，暴露部分盲肠，在回盲肠连接处结扎，用注射器针头将盲肠刺穿两次，挤压盲肠并将盲肠送回腹腔。B组的大鼠开腹后仅把盲肠取出并回纳后关闭腹腔。术后给予足够的水及营养支持。D组大鼠皮下注射胸腺肽α1（日达仙，购自美国赛生药品公司）每次0.18mg/kg，共2次，A、B、C组皮下注射等剂量生理盐水作为对照。

1.2心脏超声检测心功能开始用药36h后，将各组大鼠分别水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧固定、备皮，使用Agilent Sonos 5500型彩色多普勒超声（美国Philips公司）12 MHZ探头行心脏彩超，检测心功能，测定射血分数（EF），左室短轴缩短率（FS）指标。

1.3TNF-α、NO和p38 MAPK表达检测快速取出心脏用冷生理盐水冲洗后，取心尖周围组织约40mg用磷酸盐缓冲液制备组织匀浆，离心后收集上清。TNF-α和NO含量测定用ELISA法（试剂盒购自南京建成生物工程研究所），严格按照试剂盒的操作说明；Western blot法测定p38 MAPK表达：将心肌组织洗涤，加入细胞裂解液静置后离心，取上清，经SDSPAGE分离，转移到PVDF膜上。封闭后加入抗p38及磷酸化-（Phosphorylated-，p-）p38抗体（购自Sigma公司），显色后用凝胶成像系统扫描分析结果，计算灰度比值，以表示目的蛋白激活相对含量。

1.4形态学观察取出心尖组织，立刻甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋、切片及HE染色，光学显微镜下观察病理学形态改变。

1.5统计学方法数据采用SPSS 17.0统计软件进行处理。计量资料指标以均数±标准差表示，均数比较采用单因素方差分析，检验方差齐性，方差齐组间多重比较采用LSD法，方差不齐采用Dunnett's T3法，率的比较采用卡方检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1一般情况A组和B组大鼠一般情况好，精神好，活动多，主动进食进水，呼吸平稳，四足温暖。C组和D组大鼠精神差，胃口差，呼吸促，C组四足发绀，懒动更加明显，3只因濒临死亡提前结束观察并取材。D组大鼠四足仅轻度发绀。

2.2心脏超声检查结果各组大鼠心脏超声结果提示，A、B两组EF、FS无明显差异；C、D组较A组EF值降低，C组EF值显著低于D组（P=0.041），差异具有统计学意义，C、D组FS值无显著性差异（P= 0.075），见表1。

表1　各组大鼠心脏超声结果（x±s,％）

2.3各组大鼠心肌匀浆的TNF-α和NO含量A组和B组大鼠的TNF-α和NO含量无显著性差异，C、D组TNF-α和NO含量显著高于A、B组，C组TNF-α和NO含量显著高于D组（P值分别为0.032和0.027），见表2。

表2　各组大鼠TNF-α和NO含量变化（±s）

表2　各组大鼠TNF-α和NO含量变化（±s）

注：与A组比较，＊P＜0.05，与C组比较，#P＜0.05

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2.4p38 MAPK表达测定C组p-p38/p38灰度值比值（0.72±0.15），显著高于A组（0.37±0.10）及B组（0.38±0.08），D组灰度比值（0.54±0.12）较C组下调，差异均具有统计学意义（P=0.019），见图1。

图1　各组p-p38/总p38的灰度比值

2.5各组大鼠心肌形态学观察大鼠光镜下结果比较，A、B组大鼠心肌肌纤维结构排列紧密、无水肿、充血及渗出。C组心肌肌纤维结构排列疏松，带状空泡化，细胞核肿胀，间质水肿、充血。D组心肌肌纤维结构有点状空泡化改变、间质水肿、充血程度同C组比较明显减轻，见图2。

图2　光镜下观察各组心肌组织病理改变

3　讨论

脓毒症是感染引起的全身炎症反应，是重症患者主要死亡原因之一，其发病机制及治疗方法的研究始终是重症医学领域的热点。但是，脓毒症的发病率和病死率居高不下，全球每年增加的数百万脓毒症患者中，病死者超过25％[2]。尤其是当脓毒症患者出现心肌损害，患者的氧输送能力进一步下降，其病情往往迅速恶化，预后更差。集束化治疗概念的推广和广谱抗菌药物的不断开发，未能显著改善脓毒症患者的预后，这是令人失望的事实。脓毒症瀑布式的炎症反应，是造成器官损害的直接原因之一，如果能早期阻断炎症反应的进展，理论上可能保护重要脏器功能，改善患者预后。近年来，免疫治疗的重要性正逐渐被人认识，人们期望通过平衡患者体内的抗炎和促炎反应水平，提高患者的免疫功能，但至今未取得重要的临床依据和广泛共识[3-5]，仍有待进一步探索。

胸腺肽α1是目前主要的免疫调理药物之一，临床上容易获得，研究基础扎实，被认为可以较好地调节T细胞免疫功能[6]，还具有内源性调节固有免疫和获得性免疫的作用[7]。近期，管向东等的研究指出，胸腺肽α1在联合传统药物治疗的基础上，使患者具有更高的mHLA-DR水平，能改善免疫系统功能，对改善临床预后可能是有效的[5]。但是，作为重要的损害靶器官，心肌是否能获益于胸腺肽α1的免疫保护作用，至今仍无研究涉及。笔者针对这一问题，设计了该项随机对照的动物实验，以探讨胸腺肽α1对脓毒症心肌损害的保护作用。

目前的主流观点认为，脓毒症心肌损害的致病通路是：细菌的脂多糖成分激活p38 MAPK，使其磷酸化，并协同核转录因子κb，显著增加TNF-α的表达。TNF-α是至关重要的炎症因子。研究表明，心肌组织分布的巨噬细胞可表达大量的TNF-α，它可促进巨噬细胞释放其他炎症因子诱导心肌炎症反应[8]，诱导心肌细胞凋亡[9]，并可直接导致心肌收缩力下降[10，11]。此外，TNF-α可以诱导NO的表达，并通过NO依赖途径对心肌细胞进行损伤[12]。因此，本研究选择该条通路上的几个主要靶点作为标志物（p38 MAPK、TNF-α及NO），来衡量胸腺肽α1对该条通路的调节作用。

本研究发现，胸腺肽α1可以抑制p38 MAPK的磷酸化和激活，抑制TNF-α的表达，且抑制NO的合成。理论上推测，胸腺肽α1可以通过抑制上述通路的炎症反应，对脓毒症心肌损害起到保护作用。这一推测，通过心脏彩超检查及组织病理学观察结果得到证实。EF值是超声评估大鼠心功能的首要指标[13]，本研究发现，胸腺肽α1干预后大鼠心EF值较脓毒症组明显提高，大鼠心收缩功能改善。病理观察也显示，胸腺肽α1使心肌组织损害程度减轻。总之，本研究初步阐明胸腺肽α1可能通过抑制p38 MAPK途径对脓毒症大鼠心肌损害具有一定的保护作用，希望为临床应用提供理论支持。

参考文献

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[2015-11-10收稿，2015-12-09修回]

[本文编辑：韩仲琪]

医学信息研究

Protective effect of thymosin α1 against myocardial damage in septic rats

ZHANG Ming，LIN Qin-han，CHEN Jun，et al. Department of Intensive Care Unit，Qingyuan People's Hospital，Qingyuan，Guangdong 511500，China

[Abstract]ObjectiveTo investigate the possible mechanism of the protective effect of thymosin α1 against myocardial damage in septic rats. Methods Forty male rats were randomized into four groups：the control group，sham group，septic group and thymosin group. Cecal ligation and puncture operation were performed on the four groups to establish animal model of sepsis. Echocardiography was performed to evaluate the related indexes of cardiac function. The tissues of myocardium were harvested and the tissular concentration of the activated p38 mitogen-activated protein kinases，tumor necrosis factor-α and nitric oxide were measured. After HE staining，tissue sections were observed to evaluate the change of histomorphology. ResultsThe concentration of the activated p38 mitogen-activated protein kinases，tumor necrosis factor α and nitric oxide in the septic group were higher than that in the control group and sham group. Thymosin α1 attenuated the expression of the activated p38 mitogen-activated protein kinases，tumor necrosis factor α and nitric oxide，and augmented the EF value of hearts. Conclusion Thymosin α1 may prevent myocardial damage from sepsis through inhibiting the p38 MAPK pathway.

[Key words]Thymosin α1；Sepsis；Rat；Myocardial damage

[中图分类号]R542.2

[文献标志码]A

DOI：10.14172/j.issn1671-4008.2016.05.019

[基金项目]广东省清远市科技计划项目（2015B030）

[作者单位]511500广东清远，清远市人民医院重症医学科（张明，林钦汉，陈军，温振杰，刘建凌）