人肠三叶因子重组真核表达载体的构建及在CHO/dhfr-细胞中的稳定表达

朱融和，陈慧瑶，庄强，江松福

（温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325015，1.儿科；2.血液内科）



人肠三叶因子重组真核表达载体的构建及在CHO/dhfr-细胞中的稳定表达

朱融和1，陈慧瑶2，庄强2，江松福2

（温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325015，1.儿科；2.血液内科）

目的：构建人肠三叶因子（hITF）重组真核表达载体，并检测其在CHO/dhfr-细胞中的表达。方法：通过重叠延伸PCR法获得hITF cDNA片段，将目的基因插入真核表达载体pIRES/dhfr，得到重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr；经脂质体介导转染CHO/dhfr-细胞，通过G418筛选，建立稳定转染的CHO/dhfr-细胞系；用RT-PCR及ELISA法检测hITF的表达。结果：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr，并建立了稳定转染的CHO细胞系，成功地表达了目的基因。结论：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr，并在CHO/dhfr-细胞中分泌表达hITF蛋白，为进一步进行重组hITF的临床前研究奠定良好的实验基础。

人肠三叶因子；真核表达载体；CHO/dhfr-细胞

人肠三叶因子（human intestinal trefoil factor，hITF）属于三叶因子家族中的一员，由59个氨基酸残基构成，其中含有6个高度保守的半胱氨酸序列，形成3对二硫键，从而产生特异而稳定的三叶草结构，这种稳定的结构，使其不受消化酶及pH值的影响，确保在胃肠道中发挥作用。体内外实验［1-3］证实，hITF是一种重要的胃肠黏膜保护因子，其作用可能是通过与黏液糖蛋白形成稳定的凝胶层复合物，保证了肠道屏障的完整性。目前多采用基因重组的方法获得hITF。国内报道［4］在大肠杆菌中表达出重组hITF，表达量为3～4 mg/L，但缺乏必要的折叠、修饰等后期加工，蛋白活性大大降低。本研究通过构建重组真核表达载体，转染CHO/ dhfr-细胞，G418筛选获得稳定表达细胞克隆，并对表达产物进行鉴定，为进一步进行重组hITF的临床前研究奠定良好的实验基础。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1质粒、菌体及细胞系：真核表达载体pIRES/dhfr由复旦大学遗传所陶建军博士赠送；hITF的克隆质粒pSG5-hITF由法国Catherine Tomasetto教授赠送；大肠杆菌DH5α由本实验室保存；CHO/dhfr-细胞购自中国科学院上海生科院细胞库。

1.1.2主要试剂和限制性内切酶：限制性内切酶（NheI、EcoRI）、T4 DNA Ligase购自美国NEB公司；DNA Marker DL2000购自加拿大Fermentas公司；高纯度质粒小提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；凝胶回收试剂盒购自德国Qiagen公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；F12培养基及HT购自美国Gibco公司；胎牛血清及透析胎牛血清购自奥地利PAA公司；RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司；hITF ELISA试剂盒购自武汉伊艾博科技有限公司；G418购自美国Amresco公司；其余化学药品均为进口分装或国产分析纯。

1.2方法

1.2.1PCR引物设计：根据pSG5-hITF质粒的hITF基因序列比对NCBI上hITF序列，发现其前面信号肽少了32 bp，故用重叠延伸PCR法，共设计5条引物：Homo-TFF3-P1：CCG GCTAGCACCATGAAGCGAGTCCTGAG CTGC（下划线部分为NheI酶切位点）；Primer1：GAG CTGCGTCCCGGAGCCCACGGTGGTCATGGCTGC；Primer2：ATGAAGCGAGTCCTGAGCTGCGTCCCGGAGCC；Primer3：CAGAATGCACCTTCTGAG；Homo-TFF3-P2：CTAGAATTCTC AATGGTGATGGTGATGATG GAAGGTGCATTCTGCTTCCT（下划线部分为EcoRI酶切位点，方框部分为6组氨酸标签）。

上游引物加入NheI酶切位点及其保护性碱基，下游引物加入EcoRI酶切位点及其保护性碱基，同时下游引物还引入6组氨酸标签以便于后期的检测、纯化。上述引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2.2目的片段的扩增：第一轮PCR：用Primer1和Primer3作为一对引物进行扩增，反应体系为50 μL，94 ℃预变性5 min，后94 ℃、57 ℃、72 ℃各30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后切胶，用QIAquick gen extraction kit进行目的片段回收。第二轮PCR：以第一轮PCR的回收产物为模板，用Primer2和Primer3作为一对引物进行扩增（反应体系同上述），扩增产物电泳回收（同上述）。第三轮PCR：以第二轮PCR回收产物为模板，用Homo-TFF3-P1和Homo-TFF3-P2作为一对引物进行扩增（反应体系同上述），扩增产物电泳回收（同上述）。

1.2.3重组真核表达栽体pIRES/hITF/dhfr的构建：以pIRES/dhfr为真核表达载体，将载体及目的基因片段均用NheI和EcoRI进行双酶切，酶切产物分别经l.0%和1.5%琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收后，用T4 DNA Ligase连接目的片段和线性空载体质粒。产物转化感受态的大肠杆菌DH5α，在含有Amp抗性的LB平板上涂板。第2天挑取单克隆，37 ℃振荡培养12～16 h。提取重组质粒，进行EcoRI、NheI双酶切鉴定。将酶切鉴定阳性的重组质粒pIRES/hITF/dhfr送上海英骏生物技术有限公司进行测序，以确定插入片段的核苷酸序列和阅读框架的正确性。

1.2.4转染CHO/dhfr-细胞：CHO/dhfr-细胞培养于含10% FBS的F12培养液中，置于37 ℃含5% CO2的培养箱中孵育。CHO/dhfr-细胞转染前24 h以每孔6×105个细胞转于6孔板。24 h后，细胞覆盖孔底大致致密。以4 μg/孔的量进行转染操作，同时设空载体质粒组和空白对照组，按照LipofectamineTM2000说明书进行操作。

1.2.5阳性细胞克隆的筛选：转染后48 h，细胞以1:10密度传代，并在700 μg/mL G418的F12培养液中培养，每2～3 d更换相同培养液并观察阳性克隆生长情况。1周左右空白对照组细胞脱落死亡，将转染组长出的抗性细胞群用胰酶消化后转至新的6孔板中继续培养，用300 μg/mL G418浓度维持，直到细胞生长至汇合后进行检测。

1.2.6RT-PCR检测hITF转录水平的表达：收集CHO/ dhfr-空质粒转染细胞以及转染目的基因的CHO/ dhfr-细胞，按Trizol试剂说明书分别提取总RNA，取1 μg进行反转录。反转录10 μL系中加入总RNA 1 μL随机引物0.5 μL，10×RT Buffer 1 μL，dNTP （10 mmol/L）1 μL，RNase Inhibitor 0.25 μL，AMV反转录酶0.5 μL，MgCl22 μL，ddH2O补足至10 μL，混匀，30 ℃ 10 min，57 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min终止反应。以β-actin（464 bp）为内参进行PCR反应。在40 μL反应体系中加入cDNA模板5 μL，5×PCR缓冲液10 μL，TaKaRa Ex Taq HS 0.25 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O补足至45 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s（30个循环）；72 ℃继续延伸5 min。取等体积RT-PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳并照相。

1.2.7 分泌型融合蛋白的双抗体夹心ELISA鉴定：在筛选出阳性克隆后，按每孔5×105个细胞接种于6孔板中，无血清培养液培养48 h，取细胞上清液于无菌的离心管中，2 500 r/min离心20 min，取上清液，严格按照hITF的ELISA试剂盒操作说明书进行检测。

2　结果

2.1目的基因片段的PCR扩增 PCR反应产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，经过三轮PCR，最终在300 bp左右处可见特异性扩增条带，与预期相符（见图1）。

图1　SOE-PCR法扩增展hITF基因电泳图

2.2重组真核表达质粒pIRES/hITF/dhfr的构建及鉴定 分别将真核表达载体pIRES/dhfr和hITF基因双酶切，回收纯化目的片段，在连接酶作用下连接构建重组表达质粒，转化后挑选转化克隆的数个菌落扩大培养，小量提取重组质粒，经NheI和EcoRI双酶切，电泳显示重组质粒可切出2个条带，其中有一条带在300 bp左右，提示重组成功（见图2）。2.3 测序结果 序列测序结果表明，目的基因与GenBank中登录的hITF cDNA的序列（NM_003226）完全一致，见图3。

图2　重组质粒pIRES/hITF/dhfr的EcoRI和NheI双酶切产物电泳图

图3　重组表达质粒pIRES/hITF/dhfr测序部分结果

2.4转染CHO/dhfr-细胞 转染后48 h，细胞以1:10密度传代，并在培养基中加入G418筛选，转染了pIRES载体的细胞因为具有neo抗性而存活下来，不断增殖成为细胞抗性克隆，第14～16天，6孔板内剩下约6～8个细胞集落；正常对照组细胞由于没有neo抗性，故在含有G418的培养基中将不能存活，并在培养基中可见大量死细胞和细胞碎屑，1周左右死亡、脱落。

2.5RT-PCR检测hITF在CHO/dhfr-细胞中的整合与转录 提取重组质粒组及空载体质粒组筛选后的CHO/dhfr-细胞总RNA。重组质粒组扩增出一条300 bp左右的特异性hITF基因产物，而空载体质粒组则未见相应的扩增条带，提示hITF基因成功整合入CHO/dhfr-细胞的基因组并可转录为mRNA，RT-PCR扩增结果见图4。

图4　转染后RT-PCR检测hITF基因在CHO/dhf-细胞中的转录

2.6双抗体夹心法ELISA结果 加入转染了pIRES/ hITF/dhfr的CHO/dhfr-细胞上清液的孔在加入显色剂孵育15 min后呈现了明显的肉眼可见的蓝色，而空白对照孔、未转染细胞上清孔和空载体质粒组孔均未出现显色反应，说明这些标本中不含有hITF蛋白，而转染了hITF基因的CHO/dhfr-细胞能分泌蛋白。标准品及标本在酶标仪上测其OD450值，用curve expert 1.3软件根据标准品OD450值及标准品浓度绘制的hITF蛋白标准曲线（r=0.9999）。用该软件计算出转染了重组质粒组的CHO/dhfr-细胞上清液标本中hITF蛋白的浓度0.163 mg/L。

3　讨论

hITF属三叶肽家族，生理状况下存在于哺乳动物的多种组织中，但主要分布在肠道，整个肠道中以十二指肠含量最高，空回肠次之，此外，在唾液腺、下颌下腺、胰腺及宫颈黏液中也有少量表达［5-7］。相关研究发现［2-3］，hITF在维持肠道黏膜完整性、促进肠黏膜损伤后的重建和修复中有着独特的重要作用，阻止多种蛋白酶以及机械应力改变等因素造成的肠黏膜损伤。hITF还与肿瘤发生发展关系密切，可作为多种肿瘤的生物标志物，应用于肿瘤的诊断、治疗与预后评价等［8-14］。

目前，重组hITF主要为来自大肠杆菌或酵母菌2种细胞系的表达产物。有报道［4］用大肠杆菌表达hITF，但由于大肠杆菌表达的重组hITF缺乏必要的折叠、修饰等后期加工，因此该蛋白活性大大降低。Thim等［15］报道的表达体系由于采用了酿酒酵母丙糖磷酸异构酶的启动子和终止子，使得表达的融合蛋白能直接分泌到细胞外，其效率达100 mg/L，但该系统仍具有一定的局限性［16］，如表达的蛋白过度糖基化等。哺乳动物细胞表达体系翻译后的加工修饰体系更完善，产生的外源蛋白质更接近于天然蛋白质，因此我们选择了CHO细胞表达体系。目前研究［17］结果显示，决定重组蛋白在哺乳动物细胞中表达水平的因素是多方面的，包括目的基因在基因组上的拷贝数，目的基因在基因组的整合位点以及启动子强度等。其中，实现目的基因在细胞基因组中转录活跃区的整合是一个关键因素。弱化筛选基因，从而提高目的基因在热点整合克隆的概率是一种思路。本研究所采用的载体为pIRES，在上游强启动子CMV的控制下，该序列可和与之相连接的基因同时转录，翻译出不同的蛋白。位于IRES序列两侧的2个多克隆位点可以高效表达2个基因。一般来说，IRES序列后面的基因的表达量要低10倍左右。因此，我们在多克隆位点A插入目的基因，多克隆位点B插入二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，dhfr）基因，弱化了筛选基因，从而实现外源基因高效表达的目的。

本实验成功构建了重组真核表达载体pIRES/ hITF/dhfr，采用PCR、酶切及DNA序列测定等多种方法验证，保证了结果的可信性。转染到CHO/dhfr-细胞中，通过G418筛选和基因组DNA的PCR分析等方法，成功建立了一个在基因组DNA中稳定整合有pIRES/hITF/dhfr的CHO细胞克隆。然后将该细胞克隆的细胞扩增，提取总RNA，RT-PCR鉴定hITF基因的mRNA水平。为了方便蛋白大量生产以及后期纯化，实验者通常会选择在载体或者目的片段上添加信号肽序列，这样可以增强蛋白的胞外分泌能力，本实验选择在目的片段上添加信号肽序列，取细胞培养上清液，ELISA方法检测到有hITF蛋白的表达。CHO/dhfr-细胞自身缺失dhfr，所以必须在添加了次黄嘌呤、胸腺嘧啶的培养液中才能得以存活。而通过目的基因与dhfr基因共转染，不仅可在不含HT的培养基上生长，更为重要的是由于dhfr可被叶酸类似物MTX所抑制，在MTX浓度选择压力下，dfhr基因可自发在染色体上扩增，从而产生更多的dhfr来维持细胞的正常代谢。当其扩增时，可以连带它两侧几十至上千kb的序列一起扩增，也就实现了目的基因剂量的扩增，从而极大地提高了目的基因的表达产量［18］。Hwang等［19］用目的基因转染CHO/dhfr-细胞，经过3个浓度MTX加压后，目的蛋白产量比加压之前增加了57倍。本实验由于时间仓促，未进行MTX加压实验，下一步实验可进行加压，蛋白产量相信会有所提高。

综上所述，本研究成功构建了带有hITF基因的重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr，高效转染CHO/dhfr-细胞，经过G418筛选，在细胞培养上清液中检测到hITF蛋白表达，为进一步进行重组hITF的临床前研究奠定良好的实验基础。

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（本文编辑：赵翠翠，丁敏娇）

Construction of recombinant eukaryotic expression vector of human intestinal trefoil factor and its expression in CHO/dhfr- cells

ZHU Ronghe1，CHEN Huiyao2，ZHUANG Qiang2，JIANG Songfu2. 1.Department of Pediatric，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325015； 2.Department of Hematology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325015

Objective： To construct eukaryotic expressing vector of human intestinal trefoil factor and express hITF protein in dihydrofolate reductase-defcient Chineses hamster ovary cells （CHO/dhfr-）. Methods： The full length cDNA fragment was amplifed by overlap extension PCR，then inserted into eukaryotic expression vector pIRES/dhfr. The recombinant vector was transfected into CHO/dhfr- cells by LipofectamineTM2000. The stable transfected CHO/dhfr- cell line was then established by screening cultures with G418. RT-PCR and ELISA were used to detect the expression of the protein. Results： The eukaryotic expression vector was constructed successfully，stable transfected CHO cell line was established，and hITF protein was expressed successfully. Conclusion： The recombinant plasmid pIRES/hITF/dhfr is successfully constructed and it expresses the protein in the supernatant of the CHO/dhfr- cells，which is the basis for pre-clinical study.

human intestinal trefoil factor； eukaryotic expressing vector； CHO/dhfr- cells

Q786

A DOI： 10.3969/j.issn.2095-9400.2016.08.003

2015-11-24

浙江省自然科学基金资助项目（Y207422）；浙江省医药卫生科学研究基金（2007A137）；温州市科技局合作项目（H20090010）。

朱融和（1985-），女，浙江温州人，住院医师，硕士。

江松福，教授，副主任医师，硕士生导师，Email：jiangsf@188.com。