慕萨莱思酒发酵过程中氨基甲酸乙酯含量的变化研究

刚虎军，王伟华*，苑贝贝，田木星，王文静，谢丽静

（塔里木大学生命科学学院新疆生产建设兵团南疆特色农产品深加工重点实验室，新疆阿拉尔843300）

慕萨莱思酒发酵过程中氨基甲酸乙酯含量的变化研究

刚虎军，王伟华*，苑贝贝，田木星，王文静，谢丽静

（塔里木大学生命科学学院新疆生产建设兵团南疆特色农产品深加工重点实验室，新疆阿拉尔843300）

氨基甲酸乙酯（EC）是发酵食品中存在的一种致癌物质，该研究以新疆阿瓦提慕萨莱思酒为研究对象，检测发酵过程中不同阶段EC含量、尿素含量、酒精体积分数，探究EC的形成与尿素、酒精含量的关系。结果显示，发酵结束后EC含量为25.6 μg/L，尿素与酒精含量越高，EC生成速率越快，慕萨莱思酒中EC含量越高，温度对EC的生成影响较大。

慕萨莱思酒；氨基甲酸乙酯；尿素；高效液相色谱法

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是葡萄酒等发酵食品中产生的一种副产物。在1943年NEULESHIP A等[1]证明EC具有致癌作用。1971年L FROTH G等[2]在发酵酒中及一些饮料中发现了EC。EC在机体内代谢过程中可转化为N-羟基-氨基甲酸乙酯，此物质可以诱导铜离子调控的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）发生损伤[3-5]，引起基因突变导致组织癌变。尿素与乙醇可生成EC，一些文献报道，发酵酒中EC的产生绝大部分来源于酵母菌降解精氨酸（Arg）的尿素循环途径[6]和乳酸菌的精氨酸脱亚胺基酶途径（arginine deiminase pathway，ADI）[7]。黄酒中的EC主要由尿素和乙醇反应生成，杨建刚等[8]对黄酒酵母发酵过程中尿素的产生变化规律做了研究，结果表明黄酒酵母在生长过程中会产生尿素并且排放到细胞外，在培养27 h后细胞内尿素质量浓度为6.04 mg/L，培养51 h后细胞外尿素质量浓度为38.64 mg/L。瓜氨酸与乙醇反应生成EC。发酵酒在酒精发酵完成后，一般都要进行苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF），苹-乳发酵对酒的酸度、风味等有重要意义。高年发等[9]对2种葡萄酒酿造过程中EC的产生含量进行研究发现，2种葡萄酒在进行苹果酸-乳酸发酵时都会产生新的EC。范春艳[10]研究赤霞珠葡萄酒发酵过程中EC变化规律时发现，酒精发酵期间（7 d）变化不明显，但在苹果酸-乳酸菌发酵期间（23～28 d）EC的增长速度明显加快。影响EC生成的因素还有乙醇浓度、酵母菌、温度等[11]。谭波涛等[12-13]对固相萃取EC法的不确定度进行了评价，结果显示当EC测量结果为21 ng/mL时，不确定度为8.7%（k=2），此方法可用于发酵食品中EC含量的测定。HERBERT P等[14]最先报道了采用高效液相色谱-荧光分析法（highperformance liquidchromato-graphyfluorescence detector，HPLC-FLD）检测酒精饮料中EC含量，实验结果显示，此法检测限为4.2 μg/L，平均回收率为96%，平均相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为6.3%，能够满足饮料中EC限量检测。宋利军等[15]采用气相色谱-质谱（gas chromatography mass spectrometer，GCMS）法调查60份江西省内生产的黄酒产品中氨基甲酸乙酯（EC）残留量。酒样添加ds-EC同位素内标，经硅藻土层析住吸附，乙醚洗脱，用GC-MS测定，内标法定量。结果表明，黄酒中EC的污染水平中EC的中位数为24.4 μg/kg，均值为35.0μg/kg，检出率为70%。该法与国标GB5009.223—2014《食品中氨基甲酸乙酯的测定》中的方法基本相同。

本研究采用高效液相色谱配荧光检测器法（HPLC-FLD）检测慕萨莱思酒发酵过程中EC含量的变化，对企业了解食品安全风险，指导消费者合理膳食等有理论指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氨基甲酸乙酯标准品（纯度＞99%）、9-羟基吨标准品（纯度＞99%）：上海安普实验科技股份有限公司；尿素标准品（纯度＞99%）、二乙酰一肟、安替比林、正丙醇、无水乙醇、正己烷、乙酸乙酯、乙醚（均为分析纯）、甲醇（色谱纯）：阿拉丁试剂公司；冰乙酸（分析纯）、浓盐酸、浓硫酸（均为分析纯）：盛威试剂责任有限公司；慕萨莱思酒样：阿瓦提刀郎穆塞莱斯有限责任公司。

1.2 仪器与设备

LC-20AD高效液相色谱仪（配荧光检测器）：日本岛津公司；TU-1900双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；DG-12D型固相萃取装置：上海乔枫仪器有限公司；TDL-5-A型离心机：上海安亭科学仪器厂；YGC型氮吹仪：江苏天邻仪器公司；BSA224S型电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 尿素含量的测定

尿素含量的测定采用比色法。

尿素标准曲线的制作：准确称取尿素标准品0.01 g（精确到0.000 1 g），溶解定容到100 mL容量瓶中，加0.1 mL三氯甲烷配成质量浓度为0.1 mg/mL尿素储备液。吸取储备液配制成质量浓度为1.00 mg/L、2.00 mg/L、3.00 mg/L、4.00 mg/L、5.00 mg/L、6.00 mg/L的尿素标准溶液。吸取标准溶液和一个空白各20 mL于7个棕色具塞试管中，加入0.02 g/mL 1.00 mL二乙酰一肟溶液，混匀；再加0.002 g/mL 2.00 mL安替比林溶液，混匀。沸水浴中加热50 min，冷却2 min。在波长460 nm处测定其吸光度值。以尿素标准溶液质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制尿素标准曲线。

慕萨莱思酒样品前处理方法：采用D301-G的大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂柱，用5%HCl溶液浸泡2 h，然后用超纯水逐级稀释至中性；接着用4%的NaOH溶液浸泡2 h，用超纯水逐级稀释至中性。取20 mL慕萨莱思酒样品于柱子中，吸附平衡后，用10 mL蒸馏水冲洗柱子，再用5 mL 15%NaCl溶液再次冲洗离子交换树脂柱。观察（葡萄酒有颜色）洗脱液无颜色变化时停止洗脱，收集洗脱液备用。按照尿素标准曲线回归方程计算慕萨莱思酒样品中尿素含量。

1.3.2 比色法方法学评价

精密度：选择在酒精发酵期26℃条件下发酵7 d的慕萨莱思酒样品进行尿素的测定，重复检测，计算结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），分析尿素检测方法的精密度。

加标回收率：对苹果酸-乳酸发酵30 d的慕萨莱思酒样品添加高、中、低（6 mg/L、3 mg/L、1 mg/L）不同质量浓度的尿素标准溶液，计算加标回收率，平均加标回收率和相对标准偏差。

1.3.3 氨基甲酸乙酯（EC）含量的测定

氨基甲酸乙酯（EC）含量的测定采用高效液相色谱-荧光分析法。

氨基甲酸乙酯标准曲线的制作：准确称取氨基甲酸乙酯标准品0.01 g（精确到0.000 1 g），用无水乙醇溶解，定容到10 mL，配成质量浓度为1 mg/mL的储备液；吸取储备液配制成10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L、80 μg/L、100 μg/L、200μg/L的氨基甲酸乙酯标准溶液。然后各取1mL0.02mol/L加入9-羟基吨溶液600 μL和1.5 mol/L盐酸溶液100 μL，混匀，置于暗处衍生30 min后，用孔径为0.22 μm的有机微孔滤膜过滤到进样瓶中待检。以氨基甲酸乙酯标准溶液质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制氨基甲酸乙酯标准曲线。

高效液相色谱-荧光分析法条件：色谱柱为C18反向色谱柱（250 mm×4.6 mm）衍生化反应时间30 min，进样量40 μL；流速0.8 mL/min；柱温30℃；流动相：甲醇和水；激发波长为233 nm，发射波长为600 nm。

慕萨莱思酒样品前处理方法：采用固相萃取法，主要操作步骤如下：对弗罗里硅藻土小柱进行活化，用50 mL二氯甲烷冲洗小柱，接着用25 mL甲醇再次冲洗小柱，最后用50 mL蒸馏水冲洗，保持硅藻土湿润状态下加慕萨莱思酒样20 mL；样液在柱中停留一段时间（30 min），用2× 20 mL正己烷淋洗小柱，弃去废液。然后加入5×30 mL丙酮:二氯甲烷（1∶9,V/V）洗脱目标化合物，收集洗脱液。最后在30℃条件下用氮气吹至快干后，以甲醇与水的混合液75∶25（V/V）定容至5 mL，取1 mL样液加入0.02 mol/L的9-羟基吨溶液600 μL和1.5 mol/L盐酸溶液100 μL，混匀，用0.45 μm有机滤膜过滤，备用。

慕萨莱思酒样品中氨基甲酸乙酯含量的检测：检测方法同标准曲线方法，根据标准曲线氨基甲酸乙酯的保留时间计算样品中对应的氨基甲酸乙酯的峰面积，按照氨基甲酸乙酯标准曲线回归方程计算慕萨莱思酒样品中氨基甲酸乙酯含量。

1.3.4 高效液相色谱-荧光分析法方法学评价

精密度：选择在酒精发酵期26℃条件下发酵7 d的酒样进行EC含量测定，多次重复检测，计算结果的RSD，分析EC测定方法的精密度。

加标回收率：对苹果酸-乳酸发酵30 d的酒样通过添加高、中、低（60 μg/L、30 μg/L、15 μg/L）质量浓度的EC标品，重复3次，计算加标回收率、平均加标回收率和RSD。

1.3.5 酒精含量的检测方法

参照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法测定样品中酒精含量。

2 结果与分析

2.1 EC含量测定结果

2.1.1 衍生时间优化结果

图1 衍生20 min(A)，25 min(B)，30 min(C)及35 min(D)条件下检测EC含量的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of EC contents under the condition of derivative time 20 min(A),25 min(B),30 min(C)and 35 min(D)

衍生时间分别在20min、25min、30 min和35 min条件下，对质量浓度为40 μg/L的EC标准液进行高效液相色谱-荧光分析法测定，结果（图1）可知，在衍生20min和25min后，EC的峰面积比衍生30 min的小，但和35 min相比差距不大，说明30 min反应效果较好。故最终选择30 min为最佳荧光反应时间。

2.1.2 EC含量测定

EC标准品的高效液相色谱图见图2。以氨基甲酸乙酯标准溶液质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制氨基甲酸乙酯标准曲线，结果见图3。

图2 氨基甲酸乙酯标准品色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of ethyl carbamate standard

图3 氨基甲酸乙酯标准曲线Fig.3 Standard curve of ethyl carbamate

由图2可知，氨基甲酸乙酯在保留时间为24.5 min左右出峰，响应值较高，出完峰后基线有漂移。由图3可知，氨基甲酸乙酯标准溶液在10～200 μg/L范围内呈良好线性关系，标准曲线回归方程为y=9471.9x+20 711，相关系数为R2为0.996 8，检出限为10 μg/L。

2.1.3 EC检测方法的方法学评价

表1 HPLC-FLD法测定精密度实验结果Table 1 Results of precision experiments analysis by HPLC-FLD

检测酒精发酵期第7天26℃条件下的EC，重复6次，测得EC含量，结果（表1）可知，EC含量测定结果相对标准偏差（RSD）为2.34%，表明该方法精密度满足要求。

在慕萨莱思酒中添加高、中、低三个水平（60 μg/L、30 μg/L、15 μg/L）EC标准溶液，进行回收率实验，重复3次。结果见表2。

表2 HPLC-FLD法测定回收率实验结果Table 2 Results of recovery rate experiments analysis by HPLC-FLD

由表2可知，EC含量的加标测定值有明显的加强，加标回收率为95.5%～98.2%，RSD为2.1%～3.3%，结果表明该法准确度良好。

2.1.4 EC含量测定结果

以酒精发酵7 d的酒样为例，测定结果见图4。慕萨莱思酒发酵过程中EC含量的检测结果见图5。

图4 发酵7 d的酒样EC含量的高效液相色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of EC contents in wine sample of fermentation 7 d

由图5可知，酒精发酵前期A到B阶段EC含量几乎为零；C阶段开始产生EC，从C到E阶段EC含量不断上升，此阶段酒精发酵中期酿酒酵母容易利用谷氨酸、谷氨酰氨、氨类化合物等，氮源减少，代谢产物尿素增加与乙醇发生化学反应生成EC；E到F阶段EC含量有所减少，酒精发酵结束，酵母菌体自溶释放大量代谢物质进入酒体；F到G阶段进行苹果酸-乳酸发酵产生新的EC；到G阶段达到最大，随后又开始下降，H到M阶段EC含量基本不变，发酵基本结束。

图5 发酵过程中氨基甲酸乙酯含量变化Fig.5 Changes of EC contents during fermentation

2.2 尿素测定结果

2.2.1 尿素的标准曲线

图6 尿素标准曲线Fig.6 Standard curve of urea

采用分光光度法检测尿素，以尿素标准溶液质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制尿素标准曲线，结果见图6。由图6可知，该方法在1～6 mg/L范围内呈良好线性关系，尿素标准曲线回归方程为y=0.233 4x+0.065 1，回归系数R2=0.997 6。检出限为1.00 mg/L。

2.2.2 尿素检测方法的评价

在酒精发酵期第7天，26℃条件下检测尿素，重复6次，结果见表3。由表3可知，尿素含量测定结果相对标准偏差（RSD）为4.10%，精密度满足要求。

表3 比色法测定精密度实验结果Table 3 Results of precision experiments analysis by colorimetry

在慕萨莱思酒中添加高、中、低三个水平（6 mg/L，3 mg/L，1 mg/L）的尿素标准溶液，重复3次，结果见表4。

表4 比色法测定回收率试验结果Table 4 Results of recovery rate experiments analysis by colorimetry

2.2.3 尿素含量的测定结果

慕萨莱思酒样品在熬煮及酒精发酵阶段不同温度（22℃、26℃、30℃、34℃）条件下，每隔一段时间进行检测，结果见图7A；在苹果酸-乳酸发酵阶段前、中、后期检测尿素含量，结果见图7B。

图7 不同温度下酒精发酵（A）及苹果酸-乳酸发酵（B）过程中尿素含量Fig.7 Urea contents in the alcoholic fermentation(A)and malic acidlactic acid fermentation(B)process at different temperatures

由图7A可知，从葡萄汁熬煮到酒精发酵开始这一阶段来看，原汁中有一定量的尿素。而在酒精发酵过程中尿素含量呈上升趋势，酿酒酵母利用含氮物质，产物有尿素生成，发酵5 d左右尿素含量达到最大值，当发酵温度升高时酒中的尿素含量会有所升高。由图7B可知，在苹果酸-乳酸发酵过程中随着发酵天数的增加各不同温度下尿素含量有所增加，发酵22 d时达到最高，随后又开始下降，趋于稳定。结合各因素在生产发酵过程中温度控制在26～28℃效果最好。

2.3 酒精含量的测定结果

在22℃、26℃、30℃、34℃条件下慕萨莱思酒在酒精发酵阶段，不同发酵时期产生的酒精含量，结果见图8。

图8 不同温度下酒精发酵过程中酒精含量Fig.8 Alcohol contents in the alcoholic fermentation process at different temperatures

由图8可知，在慕萨莱思熬煮阶段不产生酒精；在酒精发酵阶段酒精不断增加，第9天以后酒精含量趋于稳定。这与EC变化规律类似，说明了慕萨莱思酒中EC含量的变化规律受到酒精含量的影响，而在苹果酸-乳酸发酵过程中酒精含量趋于稳定。温度升高，酒精发酵速度加快，酒精含量升高，说明了温度对慕萨莱思酒EC也有影响。

2.4 尿素、酒精含量与EC生成关系

各阶段酒精、尿素与EC生成的含量变化结果见图9。

图9 酒精及尿素含量与EC含量的关系Fig.9 Relationship between alcohol and urea contents and ECcontents

由图9可知，在葡萄汁熬煮和酒精发酵24 h，尿素质量浓度在0.91～0.95 mg/L左右，EC基本没有；EC的增加或下降与尿素和酒精含量的变化基本同步，推测慕萨莱思酒中EC的形成可能是尿素途径，说明了尿素和乙醇反应会生成EC。

3 结论

在慕萨莱思酒熬煮及酒精发酵前期，没有检测到EC，随后开始检测到EC，并且在酒精发酵其间含量一直上升。在苹果酸-乳酸发酵前期EC含量稍有回落，中期到后期产生新的EC含量又有上升，到后期EC含量为25.6μg/L趋于稳定。

在慕萨莱思酒熬煮到开始酒精发酵这一过程中，葡萄汁中含有1.4 mg/L的尿素。而且在熬煮过程中尿素含量有轻微下降，在酒精发酵过程中尿素含量不断上涨，发酵7 d左右达到最高。在苹果酸-乳酸发酵前期到中期尿素含量缓慢上涨，到后期有所下降，最终达到3.24 mg/L趋于稳定。

在慕萨莱思酒熬煮及酒精发酵前2 d没有酒精产生，发酵第3天开始到酒精发酵结束酒精含量不断上升，上升趋势为先快后慢，最终酒精度为9%vol趋于稳定。

综上所述酒精和尿素与EC的生成有密切的关系，EC的上升或下降与尿素和酒精含量的变化基本同步，可知慕萨莱思酒中EC的形成可能是尿素途径所产生，即尿素和乙醇反应会生成EC。

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Change of ethyl carbamate content during Musalaisi wine fermentation

GANG Hujun,WANG Weihua*,YUAN Beibei,TIAN Muxing,WANG Wenjing,XIE Lijing(Xinjiang Production&Construction Corps Key Laboratory of Deep Processing of Agricultural Products in South Xinjiang, College of Life Science,Tarim University,Alar 843300,China)

Ethyl carbamate(EC)is a kind of carcinogenic substance in fermented foods.Using the Xinjiang Awati Musalaisi wine as the research object,the EC,urea and alcohol content at different fermentation stages were detected.The relationship of EC formation with urea and alcohol content was researched.The results showed that after the fermentation,the EC content was 25.6 μg/L.The higher the contents of urea and alcohol,the faster formation rate of EC was.The higher the EC content in Musalaisi wine,the greater effect of the temperature on the formation of EC was.

Musalaisi wine;ethyl carbamate;urea;HPLC

O657.7

0254-5071（2017）01-0151-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.032

2016-10-24

国家自然科学基金（31360409，31471667）

刚虎军（1989-），男，硕士研究生，研究方向为食品加工与安全。

*通讯作者：王伟华（1977-），女，副教授，博士，研究方向为食品营养与安全。