SLE结合GC-MS法测定葡萄酒中氨基甲酸乙酯

张万利，梁新红*，冉军舰，孙俊良，莫海珍

（河南科技学院食品学院，河南新乡453003）

SLE结合GC-MS法测定葡萄酒中氨基甲酸乙酯

张万利，梁新红*，冉军舰，孙俊良，莫海珍

（河南科技学院食品学院，河南新乡453003）

建立了固液萃取（SLE）结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）法测定葡萄酒中氨基甲酸乙酯（EC）含量的检测方法。以硅藻土为吸附剂，二氯甲烷为萃取溶剂，对葡萄酒中氨基甲酸乙酯进行萃取。结果表明，二氯甲烷用量为70 mL，酒样中乙醇体积分数低于12%，萃取效果最佳。EC在200～1 600 μg/L范围内线性关系良好（R2=0.997 9）。加标回收率为91.30%～99.90%，相对标准偏差（RSD）为1.26%～1.98%，方法的精密度RSD值为1.61%～3.06%。表明该方法准确度高、重现性和精密度良好，适合用于葡萄酒样品中EC含量的检测。

固液萃取；气相色谱-质谱联用法；葡萄酒；氨基甲酸乙酯

葡萄酒酿造过程中，瓜氨酸和尿素等物质和乙醇自发反应会生成致癌物氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）[1-2]，其为2A类致癌物[3]，加拿大、美国等国家对葡萄酒中EC含量规定了限量标准，世界卫生组织提议世界各国规定酒类饮料中EC的限量标准。

目前，葡萄酒中EC含量的检测多采用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrography，GC-MS）法[4-5]。应用GC-MS方法检测食品中痕量成分的前处理过程不仅耗时、操作过程繁琐，而且较易引入分析误差，因此，选用的样品前处理方法直接影响到GC-MS仪器分析的成本、准确性和实用性。样品前处理方法主要有液/液萃取（liquid liquidextraction，LLE）、固相萃取（solidphaseextraction，SPE）、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）等[6-11]。

液/液萃取是传统的GC分析的前处理方法，其操作过程简单，但因作为萃取剂的有机溶剂和水相存在乳化现象，分析结果的精密度及准确度均较低。固相萃取法是基于液相色谱理论的一种分离纯化方法，虽然没有出现乳化现象，但萃取剂消耗量大[6,14-15]。固相微萃取方法简便、快速且不需萃取溶剂，但方法的精密度和准确度较低[8-9]。因此前处理方法中减少萃取溶剂消耗量且提高检测结果的精密度和准确度是GC-MS检测中亟待解决的重要关键问题。固液萃取是将具有高效、高选择性和吸附性的硅藻土和待测样品混合均匀，置入玻璃色谱层析柱中，然后用萃取溶剂以一定的速率进行洗脱目标检测物的方法。目前，少见固液萃取应用于GC-MS分析前处理方法的文献报道。

本研究采用SLE前处理方法对葡萄酒样品进行萃取，结合GC-MS法检测葡萄酒中EC含量。以期快速准确测定葡萄酒中EC含量，为葡萄酒质量控制提供技术方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄酒样品：市售；氨基甲酸乙酯（纯度＞99%）、丙酮（色谱纯，纯度≥99.9%）、乙醇（色谱纯，纯度≥99.8%）：美国Sigma-Aldrich公司；氨基甲酸丙酯（n-propyl carbamate，nPC）（纯度＞98%）：美国Sigma公司；Celite 545 coarse硅藻土：美国Fluka公司；二氯甲烷（分析纯）：上海恒岳化工科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Thermo Trace GC ultra-DSQ GC-MS：美国Finnigan公司；DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国安捷伦公司；SENCO W201旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 EC模式溶液和nPC内标溶液的配制[14]

将一定量的EC和nPC标准品分别溶于色谱级丙酮中，分别配制成10 000 μg/L的EC丙酮溶液和nPC丙酮溶液，备用。分别取4.0 mL 10 000 μg/L的EC丙酮溶液和8.0 mL 10 000 μg/L的nPC丙酮溶液，充分混匀，然后用蒸馏水稀释至100 mL，稀释后溶液即为EC模式溶液，溶液中EC和nPC含量分别为0.4 μg/mL和0.8 μg/mL。

取含量为10 000 μg/L的nPC丙酮溶液8 mL，用蒸馏水稀释至100 mL，即为800 μg/L的nPC内标溶液。

1.3.2 SLE操作方法及EC标准曲线的绘制

EC-nPC标准溶液配制：用蒸馏水将EC丙酮溶液（10.0 μg/mL）和nPC丙酮溶液（10.0 μg/mL）进行稀释，得到以下不同含量的EC-nPC标准溶液：0.2μg/mLEC+0.8μg/mL nPC、0.4 μg/mL EC+0.8 μg/mL nPC、0.8 μg/mL EC+0.8 μg/mL nPC和1.6 μg/mL EC+0.8 μg/mL nPC。

SLE操作方法及EC标准曲线绘制：取各含量的EC-nPC标准溶液1.0 mL于烧杯中，与19.0 mL蒸馏水混合均匀，缓慢加入20.0 g硅藻土，充分搅拌均匀。将混合好的EC-nPC-硅藻土混合物装入玻璃色谱层析柱中，用二氯甲烷进行洗脱，二氯甲烷流速为2 mL/min，洗脱液用蒸馏烧瓶进行收集。洗脱液收集完毕，用10.0 g无水硫酸钠除去洗脱液中的水分，备用。

除去水分后的洗脱液在30℃下用真空旋转蒸发仪进行浓缩，蒸馏烧瓶中洗脱液浓缩至4.0 mL后移至KD浓缩瓶中，用2.0 mL二氯甲烷润洗蒸馏烧瓶，润洗液完全转入KD瓶中，KD瓶中溶液在30℃下浓缩至1.0 mL后，完全移入1.0 mL离心管中。各梯度浓缩液进行GC-MS分析。以EC含量为横坐标（x），EC-nPC的峰面积比值为纵坐标（y），绘制标准曲线，获得EC标准曲线回归方程。

葡萄酒样品中EC的含量根据标准曲线回归方程和浓缩倍数计算，计算公式如下：

式中：X为葡萄酒样品中EC含量，μg/L；x为根据标准曲线获得的EC含量，μg/mL；n为浓缩倍数。

1.3.3 GC-MS分析参数[6]

气相色谱分析条件：DB-WAX毛细管色谱柱（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度190℃，柱温程序：初温40℃，保持2min，然后以10℃/min升至180℃，保持0.5min，再以50℃/min的速度升至220℃，保持4 min。载气为高纯氦气（纯度＞99.999%），流速1.0 mL/min，不分流进样，进样量1.0 μL。

质谱分析条件：电子电离（electron ionization，EI）离子源，离子源温度220℃；电子能量70 eV；接口温度220℃；电子倍增电压1 568 V；检测离子m/z 62、74、89，定量离子m/z 62；溶剂延迟10 min。

2 结果与分析

2.1 二氯甲烷用量对EC萃取的影响

选择二氯甲烷为萃取溶剂，对模式溶液中EC萃取后进行GC-MS分析，考察二氯甲烷用量为50～90 mL时对EC萃取效果的影响，结果如图1所示。

图1 二氯甲烷用量对EC萃取效果的影响(n=3)Fig.1 Effect of dichloromethane dosage on EC extraction efficiency (n=3)

由图1可知，随着二氯甲烷用量增加，EC-nPC峰面积比值迅速上升，这是因为随着二氯甲烷用量的增加，EC-nPC-硅藻土混合物中更多的EC被二氯甲烷萃取出来。但当二氯甲烷用量由70 mL增至90 mL时，EC-nPC峰面积比值变化不显著（P＜0.05），表明EC-nPC-硅藻土混合物中EC已经完全被二氯甲烷萃取。与李华等[6]报道的固相萃取前处理方法相比较，SLE方法中二氯甲烷用量减少了150.00%。因此，选择70 mL二氯甲烷作为萃取溶剂。

2.2 乙醇体积分数对模式溶液中EC萃取的影响

研究表明，检测酒精饮料中EC含量时，乙醇对EC检测结果的准确度和精确度均有较大影响[15]。因此，向模式溶液中添加乙醇，考察乙醇体积分数为3%～21%时对模式溶液中EC萃取效果的影响，结果如图2所示。

由图2可知，当乙醇体积分数为3%～12%时，EC-nPC峰面积比值在（0.528±0.031）～（0.532±0.041）范围内变化，且差异不显著（P＞0.05），随着乙醇体积分数继续升高，EC-nPC峰面积比值开始下降，可能是因为乙醇和EC对硅藻土的竞争吸附，也可能是乙醇会包裹EC形成微胶团，导致EC的挥发性降低。因此，应用SLE对葡萄酒样进行萃取时，酒样乙醇体积分数应低于12%，如果酒样中乙醇体积分数高于12%，应对酒样进行适当稀释。

图2 乙醇体积分数对EC萃取效果的影响(n=3)Fig.2 Effect of ethanol content on EC extraction efficiency(n=3)

2.3 EC标准品及样品GC-MS色谱图

在葡萄酒EC含量检测时，EC的总离子扫描质谱中，特征离子m/z 62为葡萄酒中EC含量检测的定量离子。依据1.3.3的方法，分别对标准品和葡萄酒样品进行GC-MS分析，获得EC的总离子流色谱图如图3所示。

图3 标准溶液(a)及葡萄酒样(b)中EC总离子流色谱图Fig.3 Total ions chromatograms of EC in standard solution(a)and wine sample(b)

由图3可知，标准品和葡萄酒样品中EC保留时间分别为13.31 min和13.34 min，分离效果较好，峰形良好，杂峰干扰少，可以用于实际样品中EC含量的检测。

2.4 EC标准曲线绘制

按照1.3.2操作方法，二氯甲烷用量为70 mL，应用SLE方法对系列标准溶液中EC进行萃取，并进行GC-MS分析，以EC含量为横坐标（x），EC-nPC的峰面积比值为纵坐标（y），绘制EC标准曲线，结果见图4。

图4 氨基甲酸乙酯标准曲线Fig.4 Standard curve of ethyl carbamate

由图4可知，标准曲线回归方程为y=0.607 7x+0.011 2，相关系数为R2=0.997 9，结果表明，在0.2～1.6 μg/mL范围内，EC含量和EC-nPC的峰面积比值呈良好的线性关系。

2.5 加标回收率试验

取葡萄酒样品，分别加入20 μg/L、40 μg/L、60 μg/L的EC标准溶液，按照1.3.2处理方法，采用GC-MS进行检测。计算加标回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），样品加标回收率试验结果见表1。

表1 加标回收率试验结果(n=3)Table 1 Results of adding standard recovery rate tests(n=3)

由表1可知，EC的加标回收率为91.30%～99.90%，RSD值为1.26%～1.98%，表明方法准确度较高，可以用于检测葡萄酒中EC含量的检测。

2.6 方法精密度试验

取EC含量分别为0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、1.6 μg/mL的溶液，根据建立的测定条件，分别测定6次，计算4个溶液样品的相对标准偏差（RSD），结果见表2。

表2 精密度试验结果(n=6)Table 2 Results of precision tests(n=6)

由表2可知，应用建立的方法测定4个样品溶液中EC含量，测定结果的RSD在1.61%～3.06%，表明该方法的精密度较好。

2.7 葡萄酒中氨基甲酸乙酯的测定

应用所建立的方法测定6个葡萄酒样品中氨基甲酸乙酯的含量，结果见表3。

表3 葡萄酒中EC含量检测结果Table 3 Determination results of EC content in wine

由表3可知，利用SLE前处理结合GC-MS方法检测不同类型的葡萄酒中EC含量，检测值在（8.29±0.32）～（35.96±0.95）μg/L，说明该方法能够用于不同类型葡萄酒中EC含量的检测。测定的6个葡萄酒样品中，其中5个样品的EC含量低于加拿大卫生与预防部门规定的30 μg/L。

3 结论

本研究建立了SLE前处理结合GC-MS检测葡萄酒中EC含量新方法。应用固液萃取法萃取葡萄酒中EC时二氯甲烷用量为70 mL，酒样中乙醇体积分数低于12%，萃取效果最佳。EC含量在0.2～1.6 μg/mL范围内线性关系良好（R2=0.997 9）。加标回收率为91.30%～99.90%，相对标准偏差为1.26%～1.98%。方法的精密度RSD值为1.61%～3.06%。SLE方法准确度高、重现性好。建立的葡萄酒中EC含量检测方法不出现乳化现象，有机溶剂用量少，方法准确可靠，可用于葡萄酒样品中EC含量的检测，对葡萄酒质量控制具有重要意义。

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Determination of ethyl carbamate in wine by SLE combined with GC-MS

ZHANG Wanli,LIANG Xinhong*,RAN Junjian,SUN Junliang,MO Haizhen(School of Food Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

The determination method of ethyl carbamate(EC)in wine was established by SLE combined with GC-MS.Using diatomite as adsorbent, dichloromethane as extraction solution,the EC in wine was extracted.The results showed that the optimum extraction conditions were as follow: dichloromethane dosage 70 ml,ethanol content in wine＜12%.EC had a good linear relationship in range of 200-1 600 μg/L(R2=0.997 9),the adding standard recovery rate was 91.30%-99.90%,and relative standard deviation(RSD)was 1.26%-1.98%.The RSD of method precision was 1.61%-3.06%.Due to high accurate,good reproducibility and accuracy,the method could be used for the determination of EC content in wine.

solid liquid extraction;GC-MS;wine;ethyl carbamate

TS261.7

0254-5071（2017）01-0176-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.037

2016-07-26

河南省科技计划项目(142102110127)；河南省教育厅自然科学研究资助计划项目(14A550010)；河南省高校科技创新团队支持计划项目(16IRTSTHN007)

张万利(1991-)，男，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。

*通讯作者：梁新红(1971-)，女，副教授，博士，研究方向为食品生物技术。