虫草素预处理减轻SD大鼠心肌缺血再灌注损伤*

钱国强， 张小照， 丁晶晶， 尹晓峰

(黄淮学院医学院，河南 驻马店 463000)

虫草素预处理减轻SD大鼠心肌缺血再灌注损伤*

钱国强△， 张小照， 丁晶晶， 尹晓峰

(黄淮学院医学院，河南 驻马店 463000)

目的： 研究大鼠心肌缺血再灌注(IR)损伤中，虫草素(cordycepin，Cordy)能否通过调节微小RNA-455(miR-455)的表达和减少内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)引起的凋亡发挥心肌保护作用。 方法：体重250～300 g的SD大鼠随机分为3组：对照(control)组，大鼠只进行开胸手术；IR组，大鼠心肌缺血30 min，再灌注120 min；虫草素治疗组(IR+Cordy组)：大鼠缺血再灌注前给予虫草素(10 mg/kg)股静脉注射，每天1次，共注射1周。全自动化学分析法检测大鼠血清中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)活性。TUNEL试剂盒检测心肌内皮细胞(endothelial cells, EC)凋亡率，电镜观察EC超微结构的改变。RT-qPCR法检测心肌组织miR-455及ERS介导的细胞凋亡信号通路的标志物葡萄糖调节蛋白 78(glucose-regulated protein 78，Grp78)和 caspase-12 的 mRNA表达。 结果：与control组比较，IR组EC的凋亡率明显升高(P<0.05)；与IR组比较，虫草素组EC的凋亡率明显下降(P<0.05)。与control组比较，IR组的EC线粒体肿胀，膜不规整，内皱疏松有空泡，基粒消失，核膜不规整，染色质浓集、边集，核仁消失，甚至出现凋亡小体；IR+Cordy组与IR组比较症状大为改善。与control组比较，IR组心肌组织Grp78和caspase-12的mRNA及miR-455含量均升高(P<0.05)；与IR组比较，IR+Cordy组Grp78和caspase-12的mRNA及miR-455的含量均降低(P<0.05)。 结论：虫草素可有效减轻心肌IR后大鼠心肌EC凋亡，降低心肌组织miR-455表达，抑制内质网应激。

虫草素； 缺血再灌注损伤； 内质网应激； 微小RNA-455； 细胞凋亡

冠心病是目前中老年人多发病，致残致死率高，为防治该病，消耗了大量的医疗资源[1]，其病理生理机制为缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)损伤。心肌细胞凋亡是影响缺血再灌注损伤后心功能能恢复的重要因素[2]，如何减轻心肌IR损伤引起的细胞凋亡、保护心功能，仍然是心血管领域临床研究的重要课题。虫草素(cordycepin，Cordy)为中药冬虫夏草的主要活性成分，对心、脑、肾缺血再灌注损伤及心律失常有明显防治作用，研究表明虫草素可显著降低缺血再灌注心肌的丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，改善心肌的能量代谢从而减轻缺血再灌注损伤，抑制IR诱导的心肌细胞凋亡[3-4]，但确切机制尚未明确。过强和持续的内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可引起细胞死亡[5]。研究发现，通过调控miR-455的表达，可减少ERS引起的心肌细胞凋亡，发挥心脏保护作用[6-7]。本研究观察虫草素能否通过影响miR-455表达水平，减少心肌过度ERS，发挥其对IR心肌的保护作用。

材 料 和 方 法

1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠30只，体重250～300 g，雌雄不拘，由广东省实验动物中心提供，许可证号为SCXK(粤)2008-0002。饲养条件：温度25 ℃，湿度36%，自由饮水、进食。

2 药物、试剂及实验器材

虫草素购自中国药品生物制品检定所。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒和肌酸激酶MB同工酶(creatinine kinase MB isoenzyme，CK-MB)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；TRIzol RNA试剂盒和Real Master Mix(SYBR Green)试剂盒(Tiangen)；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(凯基公司)；兔抗鼠血管性血友病因子(von Willebrand Factor， vWF)抗体(DAKO)；过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体(Jackson)；DAB染色试剂盒(中杉金桥公司)；电热恒温风干燥箱(上海跃进医疗器械厂)；TC-1205型智能程控生物组织自动脱水机/TB-718D生物组织包埋机(湖北泰维医疗科技有限公司)；AS-325切片机(Leica)。

3 方法

3.1 实验分组 30只雄性SD大鼠分为3组，每组10只。Control组：大鼠只进行开胸手术[将大鼠称重，注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，固定大鼠仰卧于手术台；剪除颈部和胸部被毛，碘伏消毒，纵形剪开颈部皮肤约1.5～2 cm；分离皮下组织及肌肉，钝性分离气管，剪开气管半周，气管插管，接呼吸机；调整呼吸频率每分钟60～80次、通气量40 mL/kg,呼吸比为2∶1，予呼气末持续正压通气；于胸骨左缘3 mm纵形剪开胸部皮肤约4 cm，钝性分离皮下、胸大肌与前锯肌，撑开胸大肌及前锯肌，显露肋骨及肋间肌，三肋间逐步剪开肋间肌；显露胸膜，以止血钳于呼气时刺破胸膜，进入胸腔]，未做缺血再灌注处理。IR组：开胸后，撑开肋骨，以小镊子撕破心包，显露心脏；探查确定左心耳，结扎位置为肺动脉圆锥与左心耳交界处下方2 mm；结扎大鼠冠脉左前降支；叠一0.8～1 mm的丝线折叠物放置于5-0线结扎线内，出针打结，5-0线结扎；缺血30 min，松开结扎，再灌注120 min。 IR+Cordy组：股静脉注射虫草素(10 mg/kg)，每天1次，持续1周，最后1次于实验前30 min注射，心肌缺血30 min再灌注120 min取材。模型复制的可靠性用连续监视心电图 Ⅱ导联的变化来判断，以ST段抬高为心肌缺血存在,以ST段回落1/2为再灌注成功。

3.2 TUNEL检测细胞凋亡 TUNEL 凋亡检测试剂盒严格按照原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，滴加抗vWF(内皮细胞标志物)抗体稀释液(1∶200)，4 ℃湿盒孵育过夜；滴加相应的过氧化物酶标记的Ⅱ抗(1∶250)，4 ℃暗室孵育1 h；DAB染色，显微镜下检测并拍照，内皮细胞胞质及胞膜呈黄褐色，胞核呈棕色。检测前对石蜡切片进行微波修复，按照试剂盒说明书操作。阳性细胞核和(或)细胞碎片呈深浅不一的棕黄色，每张切片于缺血部位随机选取8个高倍视野(×200)，分别记数凋亡内皮细胞数和内皮细胞总数并进行汇总，以凋亡细胞数占内皮细胞总数的百分比作为凋亡指数(apoptotic index，AI)，AI=凋亡细胞数/细胞总数。

3.3 电子显微镜切片制作及观察步骤 取心肌组织修成1 mm×1 mm×1 mm形状， 4%戊二醛固定液固定2 h，0.1 mmol/L磷酸缓冲液冲洗 10 min、3 次，1% OsO4浸泡2 h，0.1 mmol/L磷酸缓冲液冲洗 10 min×3 次，50%乙醇浸泡15 min，70%和90% 乙醇各浸泡15 min，90% 丙酮与90% 乙醇1∶1混合浸泡15 min，90% 丙酮浸泡15 min，100% 丙酮浸泡10 min×3次，100% 丙酮与包埋剂1∶1混合液中过夜，纯包埋剂2 h，包埋剂进入胶囊浸透(烤箱40 ℃)过夜，聚合24 h(60 ℃)，超薄切片后铅染色，电镜下观察内皮细胞形态改变。

3.4 mRNA检测方法 用TRIzol一步法提取心肌总RNA，按照Tiangen试剂盒说明书操作进行逆转录，获取cDNA。应用RT-qPCR法测定葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78, Grp78)和caspase-12的miRNA表达量及miR-455的表达水平。引物序列见表1。

3.5 LDH和CK-MB的检测方法 血液标本静置30 min，以3 000 r/min，4 ℃离心15 min，取血清按照试剂盒说明书操作。

4 统计学处理

所有数据均以均数±标准差(mean±SD)表示，应用SPSS 15.0对实验数据进行统计分析，组间数据比较用单因素方差分析及Bonferroni检验进行两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

表1 RT-qPCR的引物序列

F: forward; R: reverse.

结 果

1 心肌IR模型大鼠的心电图改变

心电图可见ST段明显抬高≥0.1 mV或T波高耸，心肌颜色变暗红色为结扎成功标志；30 min后松开结扎线, 抬高的ST段下降在 1/2以上者为缺血再灌注成功，见图1。

Figure 1.The ST segment elevation was more than 0.1 mV or T wave ascended, the myocardial turning dark and red was the symbol of success of ligation. 30 min after ligature was released, the ST elevation decreased more than 1/2 proved ischemia reperfusion model was successful.

2 虫草素对IR大鼠心肌内皮细胞凋亡及血清LDH和CK-MB活性的影响

由图2及表2可见，与control组比较，IR组心肌内皮细胞的凋亡率明显升高(P<0.05)；与IR组比较，IR+Cordy组心肌内皮细胞的凋亡率明显下降(P<0.05)。与control组比较，IR组血清LDH和CK-MB的活性均升高(P<0.05)，与IR组比较，IR+Cordy组的血清LDH和CK-MB活性均降低(P<0.05)，见表2。

Figure 2.The representitive images of the TUNEL staining to determining the apoptosis of the myocardial endothelial cells in the rats treated with cordycepin (Cordy) before IR injury (×200).

表2 血清LDH和CK-MB活性及心肌内皮细胞凋亡指数的比较

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsIR group.

3 电镜下心肌内皮细胞形态变化的观察

电镜观察可见，control组的心肌内皮细胞线粒体膜规整，嵴粒存在，内皱紧密，无空泡，核膜规整，染色质均匀，无浓集现象，核仁存在；IR组线粒体肿胀，膜不规整，内皱疏松有空泡，基粒消失，核膜不规整，染色质浓集、边集，核仁消失，甚至出现凋亡小体； IR+Cordy组与IR组比较症状大为改善，见图3。

4 大鼠心肌Grp78和caspase-12的mRNA表达及miR-455水平的比较

由表3可见，与control组比较，IR组大鼠心肌Grp78和caspase-12 的mRNA表达及miR-455 的水平均明显升高(P<0.05)；与IR组比较，IR+Cordy组Grp78的和caspase-12 的mRNA及miR-455的水平均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

Figure 3.The images of myocardial endothelial cells in the rats with different treatments observed under transmission electron microscope (×12 500).

表3 大鼠心肌Grp78和caspase-12 mRNA表达及miR-455水平的比较

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsIR group.

讨 论

虫草素是冬虫夏草的主要活性成分，其主要的药理作用有抗肿瘤、抗白血病、调节人体内分泌、增强人体免疫功能、抗菌、消炎、降血脂、降血糖、延缓衰老抑制ROS介导的血管平滑肌细胞反应、阻碍新生内膜形成等[8-10]。虫草素显著对抗心肌IR损伤，其保护作用可能是通过激活Akt/GSK-3β/p70S6K信号通路，抑制Bax裂解和caspase-3表达以及增加Bcl-2表达及Bcl-2/Bax比值来完成[4]。

细胞凋亡是细胞内死亡程序激活而导致的细胞 “自杀”行为。本研究观察到，IR时心肌内皮细胞损伤加重，线粒体明显损伤，出现凋亡；虫草素可以明显改善内皮细胞的功能，减轻内皮细胞的损伤及凋亡。内质网(endoplasmic reticulum，ER)是蛋白质合成的主要场所,蛋白质在其中折叠变化最终成为成熟蛋白质，病理条件下，未折叠蛋白或错误折叠蛋白在ER内大量堆积会损伤ER的正常生理功能，发生ERS[11]。过强和持续的ERS可引起细胞死亡[5]，Grp78被认为是内质网应激的标志物[12]，caspase-12是触发内质网应激引起细胞凋亡信号通路的特异基因[13]。miRNA可在转录后水平特异性识别靶基因的3’UTR相应靶点，并通过碱基互补配对方式与之结合，从而抑制或加速降解特定靶基因而发挥作用。研究表明，心肌高表达或特异表达的miRNA参与调控了心脏多种生理和病理过程[14-15]。

本研究结果表明，虫草素预处理能显著降低IR大鼠心肌内皮细胞凋亡率，减少CK-MB和LDH释放。同时，虫草素减少了心肌IR后ERS标志物Grp78和ERS凋亡特异性蛋白caspase-12的表达，提示虫草素可减少心肌IR后ERS介导的凋亡。另外，虫草素降低了心肌IR后miR-455的表达水平，提示miR-455可能参与了ERS引起的心肌凋亡信号通路的调节。本研究为临床上虫草素的药物开发提供了新的潜在靶点。

[1] Hausenloy DJ, Yellon DM. New directions for protecting the heart against ischaemia-reperfusion injury: targeting the Reperfusion Injury Salvage Kinase (RISK)-pathway[J]. Cardiovasc Res, 2004, 61(3):448-460.

[2] Orogo AM, Gustafsson ÅB. Cell death in the myocardium:my heart won’t go on[J]. IUBMB Life, 2013, 65(8):651-656.

[3] 刘凤芝, 李延平, 黄明莉, 等. 冬虫夏草醇提物对大鼠缺血再灌注过程心肌保护作用研究[J]. 中国病理生理杂志, 1999, 15(3):240-241.

[4] Park ES, Kang DH, Yang MK, et al. Cordycepin, 3’-deoxyadenosine, prevents rat hearts from ischemia/reperfusion injury via activation of Akt/GSK-3β/p70S6K signaling pathway and HO-1 expression[J]. Cardiovasc Toxicol, 2014, 14(1):1-9.

[5] Miyazaki Y, Kaikita K, Endo M, et al. C/EBP homologous protein deficiency attenuates myocardial reperfusion injury by inhibiting myocardial apoptosis and inflammation[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2011, 31(5):1124-1132.

[6] Belmont PJ, Chen WJ, Thuerauf DJ, et al. Regulation of microRNA expression in the heart by the ATF6 branch of the ER stress response[J]. J Mol Cell Cardiol, 2012, 52 (5):1176-1182.

[7] 康 波, 刘红明, 洪 江, 等. 硫化氢调节miRNA-455表达抑制内质网应激介导的心肌细胞凋亡[J]. 医学研究生学报, 2014, 27(12):1245-1249.

[8] 余伯成, 唐永范, 唐 亮, 等. 虫草素的药理作用研究进展[J]. 现代药物与临床, 2011, 26(5):351.

[9] Feng X. Regulatory roles and molecular signaling of TNF family members in osteoclasts[J]. Gene, 2005, 350(1):1-13.

[10]Won KJ, Lee SC, Lee CK, et al. Cordycepin attenuates neointimal formation by inhibiting reactive oxygen species-mediated responses in vascular smooth muscle cells in rats[J]. J Pharmacol Sci, 2009, 109(3):403-412.

[11]Yang C, Wang Y, Liu H, et al. Ghrelin protects H9c2 cardiomyocytes from angiotensin II-induced apoptosis through the endoplasmic reticulum stress pathway[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2012,59(5):465-471.

[12]Luo S, Mao C, Lee B, et al． GRP78/BiP is required for cell proliferation and protecting the inner cell mass from apoptosis during early mouse embryonic development[J]．Mol Cell Biol, 2006, 26(15):5688-5697．

[13]Morishima N，Nakanishi K，Takenouchi H，et al． An endoplasmic reticulum stress-specific caspase cascade in apoptosis. Cytochromec-independent activation of caspase-9 by caspase-12[J]. J Biol Chem, 2002, 277(37):34287-34294．

[14]Kang B, Hong J, Xiao J, et al． Involvement of miR-1 in the protective effect of hydrogen sulfide against cardiomyocyte apoptosis induced by ischemia/reperfusion[J]. Mol Biol Rep, 2014, 41(10):6845-6853．

[15]吴锦波, 叶小汉, 冼绍祥, 等. 中药心康方对心力衰竭大鼠心肌miR-25-3p表达水平和SERCA2a活性的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2016, 32(10):1770-1774.

(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Preconditioning with cordycepin attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury in SD rats

QIAN Guo-qiang, ZHANG Xiao-zhao, DING Jing-jing, YIN Xiao-feng

(SchoolofMedicine,HuanghuaiUniversity,Zhumadian463000,China.E-mail:gqqian1@163.com)

AIM: To study whether cordycepin (Cordy) plays a role in myocardial protection by regulating the expression of microRNA-455 (miR-455) and reducing apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress in the ischemia-reperfusion (IR) rats. METHODS: SD rats (250～300 g) were randomly divided into 3 groups: control group, the chests of the rats were only opened; IR group, the rats were given myocardial ischemia for 30 min, and then reperfusion for 120 min; IR+Cordy group: before IR, the rats were given Cordy (10 mg/kg) through femoral vein injection once a day for one week, and the last injection was given 30 min before ischemia. Automated biochemical analysis was used to detect rat serum activity of LDH and CK-MB. The myocardial endothelial cell (EC) apoptotic rate was measured by TUNEL, and the ultrastructural changes of the myocardial EC were observed under transmission electron microscope. RT-qPCR was used to detect the expression of miR-455 and the mRNA levels of glucose-regulated protein 78 (Grp78) and caspase-12 in the myocardium. RESULTS: Compared with control group, EC apoptosis in IR group was significantly increased (P<0.05). Compared with IR group, EC apoptosis in IR+Cordy group decreased significantly (P<0.05). Compared with control group, swelling of mitochondria, irregular membrane, loose wrinkles with vacuoles, disappeared matrix granules, irregular nuclear membrane, chromatin condensation, disappeared nucleoli and even small apoptosis body in the EC were found in IR group. Compared with IR group, the symptoms in IR+Cordy group were greatly improved. Compared with control group, the mRNA expression of Grp78 and caspase-12 as well as the miR-455 level in IR group was increased (P<0.05). Compared with IR group, the mRNA expression of Grp78 and caspase-12, as well as the miR-455 level in IR+Cordy group was decreased (P<0.05). CONCLUSION: Cordycepin attenuates myocardial EC apoptosis, down-regulates the expression of miR-455, and inhibits endoplasmic reticulum stress in the myocardium.

Cordycepin; Ischemia-reperfusion injury; Endoplasmic reticulum stress; MicroRNA-455; Apoptosis

1000- 4718(2017)03- 0543- 05

2016- 09- 22

2016- 11- 24

国家自然科学基金资助项目(No. 81173189)； 河南省科技攻关项目； 河南省高等学校青年骨干教师培养计划

△通讯作者 Tel: 0396-2838858; E-mail: gqqian1@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.027