ACE2内源性激动剂DIZE对糖尿病肾病大鼠的保护作用*

王园园， 曹新冉， 杨 旻， 王晓琼， 于奎鹏， 董 波△， 傅余芹△

(1山东大学第二医院肾内科，山东 济南 250033；2山东省立医院心内科，山东 济南 250021)

ACE2内源性激动剂DIZE对糖尿病肾病大鼠的保护作用*

王园园1, 2， 曹新冉2， 杨 旻2， 王晓琼2， 于奎鹏1， 董 波2△， 傅余芹1△

(1山东大学第二医院肾内科，山东 济南 250033；2山东省立医院心内科，山东 济南 250021)

目的： 观察血管紧张素转换酶2(ACE2)内源性激动剂乙酰甘氨酸重氮氨苯脒(DIZE)对糖尿病肾病(DN)大鼠的保护作用。方法: 30 只Wistar大鼠随机分为正常对照组(NC组)、DN组和DIZE处理组(DIZE组)。DN组与DIZE组一次性腹腔注射链脲佐菌素(65 mg/kg)建立糖尿病模型，12 周后糖尿病肾病大鼠模型建立后给予DIZE 15 mg·kg-1·d-1或等量生理盐水皮下注射4 周处理。16 周末称量体重和肾重，计算肾质量体质量比(KW/BW)，收集血、尿标本，检测血糖(GLU)、24 h尿蛋白(24UP)及血清肌酐(SCr)等指标。通过PAS染色观察各组肾脏病理变化；ELISA法检测大鼠AngⅡ、Ang-(1-7)、TGF-β1及VCAM-1水平的变化；通过免疫组化观察collagen I和FN蛋白表达的变化；利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测大鼠肾组织collagen I和FN mRNA含量的变化；Western blot观察各组大鼠ACE2蛋白表达的变化。结果: DIZE显著提高了糖尿病大鼠ACE2的表达(P<0.05)，降低了糖尿病大鼠血浆AngⅡ含量(P<0.05)，提高了Ang-(1-7)的水平(P<0.05)。与NC组大鼠相比，DN组与DIZE组大鼠的24UP、SCr和KW/BW明显升高(P<0.05)，collagen I和FN mRNA水平及蛋白表达量增加，肾脏组织TGF-β1及VCAM-1明显上升(P<0.05)。DIZE组与DN组大鼠相比， 24UP和SCr水平降低(P<0.05)，GLU和KW/BW无明显差异，collagen I和FN mRNA含量及蛋白表达量减少，肾脏组织TGF-β1及VCAM-1水平降低(P<0.05)。结论: ACE2内源性激动剂DIZE显著提高了ACE2的活性，增加了Ang-(1-7)的含量，从而降低了肾脏纤维化及炎症水平，并对糖尿病肾病大鼠起到保护性作用。

糖尿病肾病； 血管紧张素转换酶2； 乙酰甘氨酸重氮氨苯脒

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是最常见的糖尿病慢性微血管并发症，是终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)主要的病因[1]。研究指出肾素-血管紧张素系统(renin-angiotesin system，RAS)经典轴的过度激活，尤其是血管紧张素Ⅱ (angiotesin Ⅱ, AngⅡ)的产生增多在糖尿病的发生发展中起到重要作用[2]。近年来发现的血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是血管紧张素转换酶的同源类似物，是新型的独立的RAS成员[3-4]。国内外研究表明ACE2与心肾疾病密切相关，主要功能是将AngⅡ水解为Ang-(1-7)，从而起到抗炎及抗氧化应激等作用[5-6]。新近研究指出经典的抗锥虫药物乙酰甘氨酸重氮氨苯脒(diminazene aceturate，DIZE)是ACE2的内源性激动剂[7]。DIZE能够提高ACE2的活性，进而激活RAS的保护轴 ACE2/Ang-(1-7)/Mas。DIZE作为ACE2内源性激动剂在糖尿病肾病中对机体是否具有保护性作用尚未有明确报道。本研究主要探讨DIZE对糖尿病肾病大鼠是否具有保护性作用，从而为临床防治糖尿病肾病提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 动物

健康成年雄性Wistar大鼠30只，体重200～220 g，由山东大学实验动物中心提供。

2 主要药品与试剂

DIZE购自Fluka；链脲佐菌素购自Sigma；高碘酸-希夫染色(periodic acid-Schiff，PAS)染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；抗collagen I抗体购自Abcam；抗ACE2抗体购自Abcam；抗纤维连接蛋白(fibronectin，FN)抗体购自博奥森公司；TRIzol 试剂盒购自Invitrogen;RT-qPCR体系和SYBR Premix Ex Taq DRR041S试剂盒为TaKaRa产品;引物由上海博尚生物技术有限公司合成；大鼠AngⅡ检测试剂盒和Ang-(1-7)检测试剂盒购自北京冬歌伟业科技有限公司；大鼠转化生长因子β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)和血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1) ELISA试剂盒购自北京达科为生物技术有限公司；大鼠尿蛋白ELISA 试剂盒和大鼠血清肌酐ELISA 试剂盒购自武汉新启迪生物科技有限公司；免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司；RIPA 裂解液和苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)购自北京索莱宝科技有限公司。Tween-20 和 ECL 化学发光试剂盒购自碧云天公司。

3 仪器设备

酶标仪为Thermo产品；化学发光仪(Amersham Imager 600)购自GE；Olympus荧光显微镜购自Olympus。普通PCR仪为Eppendorf产品，RT-qPCR扩增仪为Roche产品。

4 主要方法

4.1 糖尿病肾病大鼠模型制备、分组及药物干预

30只Wistar雄性健康大鼠，体重200～220 g，随机分为正常对照(normal control, NC)组、DN组和DIZE组，每组10只。动物适应性喂养1 周后，禁食12 h，DN组及DIZE组大鼠腹腔一次性注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)65 mg/kg，正常对照组注射相同剂量的柠檬酸盐缓冲液。72 h后监测大鼠血糖，以血糖>16.6 mmol/L为糖尿病模型动物。大鼠维持性饲料继续喂养12 周，建立糖尿病肾病模型。DIZE组给予DIZE 15 mg·kg-1·d-1皮下注射4周，DN组取等量生理盐水皮下注射4周。其中DN组与DIZE组各有2 只死亡。

4.2 标本采集 16周末将大鼠置于代谢笼中，收集24 h尿液后准确称量大鼠体重，腹腔麻醉后心脏取血。取两侧肾脏称重，左侧肾脏置于-80 ℃冰箱中保存，右侧肾脏置于4%多聚甲醛中固定，用于石蜡切片制备。

4.3 一般指标检测 肾质量体质量比(%)=两侧肾重(g)/体重(g)×100%。代谢笼收集24 h尿，腹腔麻醉后心脏取血，利用ELISA试剂盒测定尿蛋白及血清肌酐浓度。

4.4 PAS染色观察肾脏病理变化 甲醛固定组织后脱水浸蜡，石蜡包埋，切片3 μm，利用PAS染色试剂盒进行PAS染色，光学显微镜拍照观察各组肾组织形态结构变化。

4.5 大鼠血浆AngⅡ和Ang-(1-7)含量的测定 心脏取血约5～10 mL， 存放于EDTA 抗凝管中，3 000 r/min， 离心 15 min后取上清于-20 ℃保存备用。采用ELISA测定血浆Ang Ⅱ和Ang-(1-7)水平，按试剂盒说明书操作，加样、孵育、洗涤、显色、终止反应。以空白孔调零，于酶标仪在 450 nm波长上读出各孔吸光度 (A)， 并根据试剂盒提供的标准品制作标准曲线， 计算各组大鼠血浆Ang Ⅱ和Ang-(1-7)的含量。

4.6 大鼠肾组织TGF-β1和VCAM-1含量的测定 ELISA测定肾组织TGF-β1和VCAM-1水平。称取约50 mg大鼠肾组织，加入生理盐水 0.5 mL，用匀浆器在冰上将标本研磨成匀浆，4 ℃、 3 000 r/min离心15 min后，吸取组织匀浆的上清液于-20 ℃保存。 依照试剂盒说明书操作，加样、孵育、洗涤、显色、终止反应，于波长 450 nm 的全光谱分光光度计上读取各孔A值，根据试剂盒提供的标准品绘制回归曲线，依次计算各组大鼠肾组织TGF-β1和VCAM-1含量。

4.7 免疫组化观察肾组织collagen I和FN的表达 肾脏组织切片经过脱蜡至水、EDTA液抗原修复、3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶、山羊血清封闭等步骤后，分别加入抗collagen I和FN的Ⅰ抗(1∶100)4 ℃孵育过夜，滴加 Ⅱ 抗，37 ℃孵育20 min，DAB 显色。显色后呈棕黄色颗粒为阳性反应。

4.8 实时荧光定量PCR检测大鼠肾组织collagen I和FN mRNA的表达 采用TRIzol法提取大鼠肾组织总RNA，取1 μg总RNA按反转录试剂盒说明书的步骤进行反转录，合成cDNA。使用Light Cycler 仪器进行PCR扩增，采用SYBR Green I染料法检测各目的基因的相对表达量，引物序列见表1。反应条件为95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 20 s，循环40 次。记录荧光信号到达设定阈值时达到的循环数(theshold cycle,Ct),采用2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。

4.9 肾组织ACE2蛋白表达的测定 取-80 ℃保存的肾组织，称重、剪碎，每100 mg加入预冷的裂解缓冲液 1.0 mL，超声破碎仪中(冰浴)匀浆3 次后置于冰上放置30 min，使其裂解充分； 4 ℃、14 000 r/min 离心15 min；吸取上清。取上清并用BCA法测定蛋白浓度。上清充分混合加 5×蛋白上样缓冲液后于100 ℃煮沸变性 10 min，于-20 ℃冰箱保存。将变性好的组织样品冰上溶解后上样，浓缩胶电压80 V，分离胶电压120 V电泳。 电泳结束后，转膜 1.5 h(经甲醇处理的 PVDF膜)，置于 5% 脱脂牛奶封闭1.5 h后，置于Ⅰ抗(ACE2及β-actin抗体分别用Ⅰ抗稀释液1∶1 000稀释)中，置 4 ℃摇床振荡过夜，1×TBST 洗 3 次，每次 15 min。 置于HRP标记的山羊抗兔Ⅱ抗( 用5%脱脂牛奶1∶5 000 稀释)中孵育 1 h，1×TBST，每次 15 min，化学发光仪发光，采用ImageJ软件处理图像。

表1 PCR引物序列

5 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间差异采用单因素方差分析比较，两两比较采用Bonferroni校正后的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 一般情况

NC组大鼠饮水、摄食、精神、皮毛及大小便均无异常；与NC组大鼠相比。DN组和DIZE组大鼠活动减少，体重减轻，血糖升高(P<0.05)。而DN组与DIZE干预组大鼠的体重和血糖差异均无统计学显著性。

2 DIZE对大鼠肾质量体质量比及生化指标的影响

与NC组比较，DN组与DIZE组大鼠的肾质量体质量比、24 h尿蛋白和血清肌酐均明显上升(P<0.05)；与DN组比较，DIZE组大鼠的 24 h尿蛋白和血清肌酐水平降低(P<0.05)，肾质量体质量比的差异无统计学显著性，见表2。

表2 各组大鼠生化指标的变化

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDN group.

3 PAS染色观察各组大鼠肾脏组织的病理学变化

PAS染色下可见，与NC组大鼠相比，DN组及DIZE组大鼠的肾小球系膜区系膜细胞及细胞外基质增生，且肾小球基底膜增厚；与DN组相比，DIZE组大鼠肾小球系膜细胞增多及系膜基质增生明显减轻，且基底膜增厚也明显减轻，见图1。

Figure 1.The representative images of PAS staining in each group under light microscope (×400).

4 ELISA测定DIZE对DN大鼠血浆AngⅡ和Ang-(1-7)含量的影响

与NC组大鼠相比，DN组大鼠血浆AngⅡ水平上升，Ang-(1-7)水平下降(P<0.05)；而与DN组大鼠相比，DIZE干预组大鼠血浆AngⅡ水平下降，Ang-(1-7)水平上升(P<0.05)，见图2。

Figure 2.Comparison of plasma AngⅡ and Ang-(1-7) in different groups. Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs DN group.

5 大鼠肾脏TGF-β1和VCAM-1含量的变化及分析

ELISA检测大鼠肾组织TGF-β1和VCAM-1含量，结果可见DN组大鼠肾组织中的TGF-β1和VCAM-1含量均较NC组明显升高(P<0.05)，而DIZE干预组较DN组大鼠明显下降，差异具有统计学显著性(P<0.05)，见图3。

Figure 3.The changes of renal VCAM-1 and TGF-β1 in each group detected by ELISA. Mean±SD. n= 8. *P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs DN group.

6 各组大鼠肾组织collagen I和FN表达的变化

Collagen I和FN为肾小球系膜区细胞外基质的主要成分，免疫组化染色下，DN组及DIZE组大鼠的collagen I和FN的表达较NC组增加，DIZE组较DN组大鼠肾脏组织的collagen I和FN表达明显降低，见图4。

Figure 4.The representative image of immunohistochemical staining for collagen I and FN in each group under light microscope (×400).

实时荧光定量PCR检测也显示DIZE组大鼠肾组织collagen I和FN的 mRNA水平较DN组明显下降(P<0.05)，见图5。

Figure 5.The mRNA expression of collagenⅠand FN in different groups. Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs DN group.

7 Western blot 实验观察各组大鼠ACE2表达

DIZE可明显增加DN大鼠ACE2的表达水平(P<0.05)，见图6。

讨 论

DN发病机制复杂，RAS系统激活、慢性炎症及间质纤维化等都在DN的发生发展中起到重要作用。研究表明DN时AngⅡ水平升高，VCAM-1、TGF-β1等因子表达增加[8]，进而促进细胞外基质如collagen I和FN的产生，促进肾脏纤维化，加重糖尿病导致的肾脏损伤。而ACE2是最近发现的RAS新成员，ACE2主要将AngⅡ 转化为Ang-(1-7)。Ang-(1-7)被认为是 AngⅡ的内源性拮抗因子，过往研究表明Ang-(1-7)可以抑制 AngⅡ引起的肾间质纤维化[9]。已经有研究指出ACE2基因过表达可减轻糖尿病导致的肾损害，其机制可能是Ang-(1-7)水平上升，进而减轻了氧化应激水平及降低了炎症因子的表达[10]。DIZE被认为是ACE2内源性激动剂，可提高ACE2的活性。已有研究指出DIZE能够通过抗氧化应激改善大鼠肾缺血再灌注损伤[11]。且DIZE在肺动脉高压及缺血导致心脏重塑的动物模型中起到保护作用[7,12]，提示DIZE可能通过抗氧化应激及抗炎改善糖尿病导致的肾脏纤维化。

Figure 6.The protein expression of ACE2 in each group by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs DN group.

本课题组成功诱导DN模型后予以DIZE 15 mg·kg-1·d-1皮下注射4周，结果显示DIZE能够增加DN大鼠ACE2与血浆Ang-(1-7)水平的表达，明显改善DN大鼠的肾脏纤维化及炎症。我们分别称重了各组大鼠的体重、肾重，计算了肾质量体质量比，检测了血糖、24 h尿蛋白、血肌酐等指标， DIZE组大鼠的24 h 尿蛋白、血肌酐较DN组明显下降。ELISA检测DN组及DIZE组大鼠肾组织TGF-β1及VCAM-1的含量明显高于NC组，而DIZE组大鼠TGF-β1和VCAM-1含量较DN组降低。免疫组化及实时荧光定量PCR显示DIZE组的collagen I和FN的表达水平较DN组明显下降。这提示DIZE能减轻糖尿病导致的肾损害，其机制可能是DIZE提高了ACE2的活性，增加了体内Ang-(1-7)水平，进而降低了肾组织炎症及纤维化水平。

ACE2是新发现的能拮抗RAS经典轴的保护性肽酶，具有肾脏保护性作用。DIZE作为ACE2的内源性激动剂，能促进ACE2的表达活性，国外已有许多研究指出DIZE具有心肾方面的保护作用。本课题研究结果表明，DIZE能通过提高ACE2的活性，增加体内Ang-(1-7)水平，下调肾脏炎症及纤维化水平，从而延缓糖尿病肾病的进展，为临床上糖尿病肾病的防治提供了新的思路。

[1] Collins AJ, Foley RN, Herzog C, et al. US renal data system 2012 annual data report[J]. Am J Kidney Dis, 2013, 61(1 Suppl 1): A7.

[2] Kamiyama M, Urushihara M, Morikawa T, et al. Oxidative stress angiotensinogen rennin-angiotensin system axis in patients with diabetic nephropathy[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(11):23045-23062.

[3] Tipnis SR, Hooper NM, Hyde R, et al. A human homolog of angiotensin-converting enzyme cloning and functional expression as a captopril-insensitive carboxypeptidase[J]. J Biol Chem, 2000, 275(43):33238-33243.

[4] Donoghue M, Hsieh F, Baronas E, et al. A novel angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase (ACE2) converts angiotensin 1 to angiotensin 1-9 [J]. Circ Res, 2000, 87(5):E1-E9.

[5] Santos RA, Ferreira AJ, Verano-Braga T, et al. Angiotensin-convertingenzyme 2, angiotensin-(1-7) and Mas: new players of the renin-angiotensin system[J]. J Endocrinol, 2013, 216(2):R1-R17.

[6] Xu P, Sriramula S, Lazartigues E. ACE2/ANG-(1-7)/Mas pathway in the brain: the axis of good[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2011, 300(4):R804-R817.

[7] Qi Y, Zhang J, Cole-Jeffrey CT, et al. Diminazene aceturate enhances angiotensin-converting enzyme 2 activity and attenuates ischemia-induced cardiac pathophysiology[J]. Hypertension, 2013, 62(4):746-752.

[8] Heidland A, Sebekova K, Schinzel R. Advanced glycation end products and the progressive course of renal disease[J]. Am J Kidney Dis, 2001, 38(4 Suppl 1): S100-S106.

[9] 张小翠， 贺红焰， 夏纪毅， 等.血管紧张素-(1-7)对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肾间质成纤维细胞活化的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2011, 27(11):2221-2224 .

[10]Liu CX, Hu Q, Wang Y, et al. Angiotensin-converting enzyme (ACE) 2 overexpression ameliorates glomerular injury in a rat model of diabetic nephropathy: a comparison with ACE inhibition[J]. Mol Med, 2011, 17(1-2):59-69.

[11]Malek M, Nematbakhsh M. The preventive effects of diminazene aceturate in renal ischemia/reperfusion injury in male and female rats[J]. Adv Prev Med, 2014, 2014: 740647.

[12]Shenoy V, Gjymishka A, Yagna J, et al. Diminazene attenuates pulmonary hypertension and improves angiogenic progenitor cell functions in experimental models[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2013, 187(6):648-657.

(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Protective effect of DIZE, an ACE2 activator, on rats with streptozotocin-induced diabetic nephropathy

WANG Yuan-yuan1, 2, CAO Xin-ran2, YANG Min2, WANG Xiao-qiong2, YU Kui-peng1, DONG Bo2, FU Yu-qin1

(1DepartmentofNephrology,TheSecondHospitalofShandongUniversity,Jinan250033,China;2DepartmentofCardiology,ShandongProvincialHospital,Jinan250021,China.E-mai:yuqinfuhappy@sina.com;dbsh2004@163.com)

AIM: To observed the protective effect of diminazene aceturate (DIZE), an angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) activator, on diabetic nephropathy (DN) rats. METHODS: Male Wistar rats (n=30) were randomly divided into normal control (NC) group, DN group and DIZE group (each group consisted of 10 rats). The rats in DN group and DIZE group were induced by intraperitoneal injection of streptozotocin at dose of 65 mg/kg. After 12 weeks, the rats in DIZE group and DN group received subcutaneous injection of DIZE (15 mg·kg-1·d-1) or vehicle for 4 weeks. The samples of blood and urine were collected at week 16, and ratio of kidney weight to body weight (KW/BW), plasma glucose (GLU), 24 h urinary protein (24UP) and serum creatinine (SCr) were measured. The renal pathological changes in each group were observed by periodic acid-Schiff (PAS) staining and immunohistochemistry. The levels of AngⅡ and Ang-(1-7) in the plasma, and TGF-β1 and VCAM-1 in the renal tissues were measured by ELISA. The mRNA and protein levels of collagen I and FN were determined by quantification real-time PCR and immunohistochemistry. The effects of DIZE on the expression of ACE2 in DN rats were determined by Western blot. RESULTS: DIZE remarkably increased the expression of ACE2 and Ang-(1-7) in DN rats. Compared with NC group, the GLU, KW/BW, 24UP, SCr, and the expression of collagen I, FN, TGF-β1 and VCAM-1 in DN group and DIZE group were increased. However, after treatment of the DN rats with DIZE, these indicators were decreased except the KW/BW. The GLU showed no significant change. CONCLUSION: DIZE raised the activity of ACE2 and increased the expression of Ang-(1-7), thus alleviating fibrosis and inflammation in the kidney and having therapeutic potential for diabetic nephropathy.

Diabetic nephropathy; Angiotensin-converting enzyme 2; Diminazene aceturate

1000- 4718(2017)03- 0469- 06

2016- 09- 18

2016- 12- 09

国家自然科学基金资助项目(No. 81170207)

△通讯作者 Tel： 0531-85875451； E-mail： 傅余芹 yuqinfuhappy@sina.com； 董 波 dbsh2004@163.com

R587.2;R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.014