cPKCγ膜转位在Herkinorin减轻 MCAO 小鼠脑缺血再灌注损伤中的作用

崔 旭 纪 方 舒洛娃 李俊发 潘楚雄*

(1.首都医科大学附属北京同仁医院麻醉科，北京 100730；2.首都医科大学基础医学院神经生物学系，北京 100069)

· 麻醉学与神经科学 ·

cPKCγ膜转位在Herkinorin减轻 MCAO 小鼠脑缺血再灌注损伤中的作用

崔 旭1纪 方1舒洛娃1李俊发2潘楚雄1*

(1.首都医科大学附属北京同仁医院麻醉科，北京 100730；2.首都医科大学基础医学院神经生物学系，北京 100069)

目的 探讨非阿片类阿片受体激动剂Herkinorin后处理的脑保护作用以及典型蛋白激酶 Cγ(conventional protein kinase Cγ，cPKCγ)的作用。方法 成年雄性C57BL/6小鼠按数字表法随机分为对照组(Naive)，假手术组(Sham)，模型组(ischemia/reperfusion，I/R)，溶剂组(I/R+D，再灌注前腹腔注射同等剂量的DMSO)，Herkinorin组(I/R+H，再灌注前腹腔注射10 mg/kg Herkinorin)。应用小鼠脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)诱导缺血性脑卒中模型，通过神经行为和运动功能检测评估脑损伤程度，借助2,3,5 -氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triph-enyltetrazolium chloride, TTC)染色观察脑梗死体积，蛋白印迹检测cPKCγ膜转位(激活)水平。结果 与I/R组比较，I/R+H 组缺血再灌注后24 h和7 d的神经行为评分明显降低，爬杆实验、圆柱体实验和步错实验测评明显改善 (P<0.05，n=6)。TTC染色显示I/R组梗死体积24 h为31.44%±5.44%，7 d为23.44%±7.95%， I/R+H 组(24 h：17.19%±3.23%，7 d：13.26%±2.71%)脑梗死体积明显减少(P<0. 05，n=6)。Western blotting结果显示，I/R组缺血核心区(Ic)和半影区(P)中cPKCγ膜转位水平都明显下降，而Herkinorin可明显减轻MCAO小鼠半影区内cPKCγ膜转位水平的降低(P<0.05，n=6)。结论 10 mg/kg Herkinorin腹腔注射能减轻MCAO小鼠皮质的缺血再灌注损伤，cPKCγ膜转位水平的变化可能参与Herkinorin后处理脑保护的分子机制。

Herkinorin；后处理；缺血再灌注；脑保护；蛋白激酶C

脑卒中起病突然，发病率、致残率和致死率都很高，目前缺乏有效的治疗方法。已有研究[1]证实药物缺血后处理(ischemic postconditioning, IPost)对缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)脑组织有保护作用。研究[2]显示阿片受体激动剂吗啡后处理具有脑保护作用，其中典型蛋白激酶 Cγ (conventional protein kinase Cγ，cPKCγ)膜转位可能参与吗啡脑保护的机制。Herkinorin是一种新型的非阿片类阿片受体激动剂，本研究拟观察Herkinorin后处理的脑保护作用以及cPKCγ膜转位水平的变化。

1 材料与方法

1.1 动物及主要试剂

1)动物：成年雄性C57BL/6小鼠，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001。标准喂养，自由饮水进食。

2)试剂：2,3,5 -氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triph-enyltetrazolium chloride, TTC)、二甲基亚枫(dimethyl sulfoxide, DMSO)购自美国Sigma公司；cPKCγ多克隆兔抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体和ECL 反应底物购自日本Chemicon公司； BCA 蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司；蛋白酶抑制剂(AEBSF、高肽蛋白酶、抑肽酶、抑胃肽酶A和胰凝乳蛋白酶抑制剂)、β-actin单克隆鼠抗体、磷酸酶抑制剂(氟化钾、冈田酸、焦磷酸钢)、DTT、NP-40、EDTA、EGTA和SDS 等均购自美国Sigma-Aldrich公司；Herkinorin 购自英国Abcam公司，使用DMSO作为溶剂。

1.2 实验方法

1)模型制备：按参考文献[3]制备小鼠脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，具体操作如下：小鼠麻醉后在显微镜下游离颈总、颈外及颈内动脉，将线栓(头端直径0.23 mm、主干直径0.18 mm)从颈外动脉小孔插入，再经颈总动脉至颈内动脉并进而向上到达大脑中动脉(深度约12 mm)。线栓阻塞1 h后恢复颈总动脉至颈内动脉的血流。整个手术和阻塞过程平均约80 min，术中敷料保温，术后放入有清洁垫料的饲养盒中，自由饮水和进食。

2)实验分组：采用数字表法随机分为对照组(Naive)，假手术组(Sham)，模型组(ischemia/reperfusion，I/R)，溶剂组(I/R+D)，Herkinorin组(I/R+H)。Sham组只进行手术操作，不插入线栓，I/R组缺血1 h后再灌注，I/R+H组在再灌注前腹腔注射10 mg/kg Herkinorin，I/R+D组在再灌注前腹腔注射同等剂量的DMSO。

3)神经行为学和运动功能评分：分别于小鼠脑缺血再灌注损害发生后24 h和7 d进行神经行为学评分(0分为无神经行为学异常，10分为死亡)和运动功能测定(爬杆实验、挂线实验、圆柱体实验和步错实验)[4]。

4)TTC染色及脑梗死体积的计算：神经行为学和运动功能测试后，迅速断头取脑，将厚约1.5 mm的脑片置于0.5%(质量分数)TTC PBS磷酸盐缓冲液中于37 ℃下孵育30 min。用参考文献[5]的方法用Imagepro plus软件分析计算梗死体积。

5)蛋白样品的制备及蛋白印迹(Western blotting)检测：缺血再灌注后24 h将小鼠断头取脑，取缺血皮质核心区(Ic)，半影区(P)和缺血对侧皮质(C)，按10μL/mg的比例加入Buffer A匀浆、离心(4 ℃、30 000×g) 30 min，取上清为胞质(cytosolic)蛋白成分；沉淀中加入等体积的Buffer B匀浆、超声、离心 (4 ℃、30 000×g) 30 min，取上清为膜相关(particular)蛋白成分[6]。BCA法蛋白定量，90 ℃加热变性5 min，20 ℃保存备用。 各组取30 g样品行电泳[10% (质量分数)SDS PAGE、 4 ℃、20～30 mA]和转膜 (PVDF膜、400 mA、3 h)，用1∶1 000的cPKCγ和β-actin分别和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔/鼠二抗进行杂交，所得 X线胶片用GeI Doc凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)扫描分析[7]。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 Herkinorin后处理可以改善MCAO小鼠神经行为学损伤和运动功能

1)神经行为学评分：缺血再灌注后24 h，Sham组小鼠神经行为轻度损伤；7 d后Sham组和Naive组小鼠神经行为学表现基本正常，神经行为学评分为0。MCAO组小鼠24 h和7 d的神经行为学功能严重损伤，主要表现为活动减少、侧倾、转圈、低反应性、前肢屈曲和运动失调等。分别于MCAO后24 h和7 d比较不同组间的差异，Herkinorin组神经行为评分明显低于I/R组，差异有统计学意义(P<0.05，n=6)，详见图1A。

2) 运动功能测定：分别于MCAO后24 h和7 d比较不同组间运动功能的差异，和Naive及Sham组相比，I/R和I/R+D组小鼠到达地面时间(time total)明显延长，I/R+H组则较I/R和I/R+D组明显缩短(n=6，P<0.05)，详见图1B。在圆柱体实验中，I/R+H组小鼠损伤侧前肢探寻烧杯壁的次数较I/R和I/R+D组明显增多(P<0.05，n=6)，详见图1C。歩错实验中，I/R+H组小鼠损伤侧肢体的肌力和协调性较I/R和I/R+D组明显改善(P<0.05，n=6)，详见图1D。

图1 Herkinorin后处理改善MCAO小鼠神经行为学和运动功能Fig.1 Herkinorin relieved neurobehavioral and sensorimotor injury in MCAO mice

A:neurobehavioral score; B:pole test; C:cylinder test; D:foot fault test. Scores and tests were compared among groups respectively at 24 h and 7 d after reperfusion(#P<0.05vsNaive and Sham,*P<0.05vsI/R and I/R+D,n=6 per group). Naive：control; Sham: sham-operation; I/R:MCAO 1 h/reperfusion; I/R+D:I/R+DMSO intraperitoneal injection; I/R+H:I/R+10 mg/kg Herkinorin intraperitoneal injection; MCAO：middle cerebral artery occlusion.

2.2 Herkinorin后处理减少MCAO小鼠脑梗死体积

TTC染色显示，I/R和I/R+D组小鼠在缺血再灌注后24 h(I/R：31.44%±5.44%，I/R+D：28.05%±3.25%)和7 d(I/R：23.44%±7.95%，I/R+D：21.05%±4.67%)有明显的白色脑缺血灶，定量分析显示与I/R和I/R+D组相比，Herkinorin后处理组(24 h：17.19%±3.23%，7 d：13.26%±2.71%)明显减少了 MCAO所致的小鼠脑梗死体积 (n=6，P<0.05)，详见图2。

2.3 Herkinorin减轻MCAO小鼠皮质半影区cPKC γ膜转位水平的下降

cPKCγ膜转位计算：以膜相关成分中cPKCγ的相对量(cPKCγ/β-actin)与胞质和膜相关成分中cPKCγ的相对量和的比值表示cPKCγ的膜转位水平，即膜相关蛋白/(胞质蛋白+膜相关蛋白)。Western blotting结果显示，缺血再灌注后24 h小鼠脑组织缺血核心区(Ic)和半影区(P)中cPKCγ膜转位水平都明显下降，而Herkinorin可明显减轻MCAO小鼠半影区内cPKCγ膜转位水平的降低(P<0.05，n=6)详见图3，对核心区cPKCγ膜转位水平的影响差异无统计学意义。

图2 Herkinorin预处理减少MCAO小鼠脑梗死体积Fig.2 Herkinorin decreased infarct volume of MCAO mice

A and C:images of TTC-stained brain coronal sections 24 h(A) and 7 d(C) after reperfusion; B and D: quantitative analysis of infarct volume (#P<0.05vsNaive and Sham,*P<0.05vsI/R and I/R+D,n=6 per group). Naive:control; Sham: sham-operation; I/R:MCAO 1 h/reperfusion; I/R+D:I/R+DMSO intraperitoneal injection; I/R+H:I/R+10 mg/kg Herkinorin intraperitoneal injection; MCAO：middle cerebral artery occlusion；TTC:2,3,5-triph-enyltetrazolium chloride.

图3 Herkinorin减轻MCAO小鼠皮质半影区cPKCγ膜转位水平的下降Fig.3 Herkinorin alleviated the decrease of cPKCγ membrane translocation levels in cortex peri-infact region of MCAO mice

A: Western blotting showed the changes in cPKCγ membrane translocation in mice cortex; B:Quantitative analysis showed that cPKCγ membrane translocation levels decreased significantly both in Ic and P regions of Naive and Sham group. Herkinorin attenuated the decrease of cPKCγ membrane translocation levels in P region of MCAO mice (#P<0.05vsNaive and Sham,*P<0.05vsI/R and I/R+D,n=6 per group). Naive:control; Sham: sham-operation; I/R:MCAO 1 h/reperfusion; I/R+D:I/R+DMSO intraperitoneal injection; I/R+H:I/R+10 mg/kg Herkinorin intraperitoneal injection; Ic: ischemic core region; P:peri-infarct region; C:contralateral cortex. cPKCγ: conventional protein kinases Cγ; MCAO：middle cerebral artery occlusion.

3 讨论

缺血后处理和预处理一样，都能减轻神经系统缺血再灌注损伤，但临床应用有局限性。药物后处理在再灌注开始前激活内源的保护机制发挥脑保护作用，临床可行性更强。阿片类药物可以通过激活阿片受体而产生不同程度的脑保护作用[8]，但阿片类药物固有的不良反应限制了其临床应用。新型非阿片类阿片受体激动剂Salvinorin A是高选择性κ阿片受体激动剂，具有起效迅速，镇静作用时间短，不产生呼吸抑制等众多优点，但其不足之处是可产生幻觉[9]。以Salvinorin A为模板合成的Herkinorin克服了这一缺陷。Herkinorin是高效的μ和 κ受体激动剂，它还具有明显的负性β-arrestin偏爱性的配体。这一特性使Herkinorin既具备传统的阿片类药物的治疗作用，又大大减少了药物耐受、便秘、呼吸抑制等不良反应[10]。

本研究显示再灌注前腹腔注射10 mg/kg Herkinorin可显著减轻小鼠脑缺血再灌注损伤，改善术后神经功能和感觉运动功能评分，减小脑梗死体积。在体研究显示Herkinorin通过舒张猪脑血管发挥脑保护作用，这种作用可能是通过κ阿片受体，而不是μ受体介导的[11]。笔者近期的研究[4]提示Herkinorin预处理能减轻MCAO小鼠缺血再灌注损伤。离体研究[2]显示吗啡后处理对氧糖剥夺小鼠海马脑片有脑保护作用。作为新型的非阿片类阿片受体激动剂，目前关于Herkinorin后处理脑保护作用的研究并不多，还需要更多的研究论证。

阿片受体是G蛋白偶联受体家族中的一员，PKCs是G蛋白偶联系统中的效应物，PKCs分为典型PKCs(cPKCα, βⅠ, βⅡ和γ)、新奇型PKCs(nPKCε, ε, η和θ)和非典型PKCs(aPKCξ和t/λ)3种。大多数PKC的亚型广泛分布于各种组织，但是cPKCγ仅存在于神经元中，且完全在大脑和脊髓中表达。在脑内其主要分布于与神经元突触可塑性密切相关的小脑、海马、大脑皮质等部位，因此它在神经系统的生理和病理功能调节中发挥着关键作用。同时cPKCγ在脑的缺血再灌注损伤中被认为是一个关键分子，具有中枢神经系统特异性。研究[12]显示cPKCγ的激活参与了胰岛素抑制神经元坏死的作用以及雌激素介导的神经保护作用，与胰岛素和雌激素一样，阿片受体激动剂也可通过外源性刺激激活神经元cPKCγ膜转位水平增高进而起到对缺血损伤的保护作用[13]。研究[2，4]显示PKCs亚型(如cPKCβI、cPKCγ、nPKCε和nPKCε)可能在阿片受体介导的吗啡预处理神经保护中发挥重要作用。小鼠离体海马脑片氧糖剥夺模型表明，cPKCγ和nPKCε均参与了吗啡预处理的神经保护作用[14]。本研究结果显示Herkinorin后处理减轻了小鼠缺血再灌注损伤后cPKCγ膜转位水平的急剧下降，提示cPKCγ膜转位也参与了 Herkinorin脑保护作用的分子机制。cPKCγ膜转位参与了吗啡和Herkinorin脑保护作用，提示2类药物可能都是通过激活相同的阿片受体发挥脑保护作用的。

本研究对Herkinorin后处理的脑保护作用和机制做了初步探索，发现10 mg/kg Herkinorin腹腔注射能减轻MCAO小鼠皮质的缺血再灌注损伤，cPKCγ膜转位水平的变化可能参与Herkinorin后处理脑保护的分子机制。Herkinorin后处理脑保护作用的受体类型还需要进一步研究。

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编辑 孙超渊

cPKCγ membrane translocation plays roles in Herkinorin postconditioning against ischemia/reperfusion injury in MCAO mice

Cui Xu1, Ji Fang1, Shu Luowa1, Li Junfa2, Pan Chuxiong1*

(1.DepartmentofAnaesthesiology，BeijingTongrenHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100730，China； 2.DepartmentofNeurobiology，SchoolofBasicMedicalSciences，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China)

Objective To evaluate the effects of Herkinorin postconditioning against ischemia/reperfusion injury in middle cerebral artery occlusion (MCAO) mice and the role of conventional protein kinase Cγ (cPKCγ). Methods Healthy adult male C57BL/6 mice were randomly divided into five groups: control group (Naive), sham-operation group (Sham), ischemia for 1 h and reperfusion group (I/R), I/R and DMSO intraperitoneal injection group (I/R+D),I/R and 10 mg/kg Herkinorin intraperitoneal injection group (I/R+H). Neurobehavioral score, Pole test, Wire hang test, Cylinder test and Foot fault test were performed at 24 h and 7 d after reperfusion. Using MCAO induced ischemic stroke mouse model, cerebral infarct volume was evaluated with TTC staining, the cPKCγmembrane translocation levels were detected with Western blotting. Results MCAO induced ischemia/reperfusion injury resulted in increased neurobehavioral scores in mice. Compared with I/R group, neurobehavioral scores of I/R+H group were decreased significantly. Ischemia/reperfusion injury affected sensorimotor function. Pole test, Cylinder test and Foot fault test of I/R+H group were relieved significantly compared with I/R group (P<0.05,n=6). TTC staining showed that infarct volumes in I/R group were 31.44%±5.44% at 24 h and 23.44%±7.95% at 7 d, infarct volumes were decreased in I/R+H group (24 h:17.19%±3.23%,7 d:13.26%±2.71%) (P<0.05,n=6). Western blotting showed cPKCγmembrane translocation levels of ischemic core and peri-infarct regions in MCAO mice cortex were decreased significantly after ischemia for 1 h and reperfusion. Herkinorin alleviated the decrease of cPKCγ membrane translocation levels in cortex peri-infarct region (P<0.05,n=6). Conclusion 10 mg/kg Herkinorin could decrease neurobehavioral score, alleviate Pole test, Cylinder test and Foot fault test evaluation, decrease infarct volumes in MCAO mice. cPKCγ membrane translocation in cortex peri-infarct region may participate molecular mechanism of Herkinorin induced neuroprotection.

Herkinorin; postconditioning; ischemia/reperfusion; neuroprotection; protein kinases C

国家自然科学基金(81301065)，北京市优秀人才培养资助计划(D003034000031)，首都医科大学附属北京同仁医院科研骨干培育基金(2014-YJJ-GGL-044)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81301065)，Talent Training Plan of Beijing(D003034000031)，Training Foundation of Beijing Tongren Hospital (2014-YJJ-GGL-044).

时间：2017-06-09 17∶39 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20170609.1739.038.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.03.002]

R614.1

2017-03-20)

*Corresponding author， E-mail：pandedao@126.com