丙型肝炎病毒抗体复查策略的研究

张菁 邵春燕 卓海龙 王海平 骆群

·论著·

丙型肝炎病毒抗体复查策略的研究

张菁 邵春燕 卓海龙 王海平 骆群

目的 探讨化学发光法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）联合酶联免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）的复查策略。方法 采用CLIA法筛选出抗-HCV S/CO﹥0.40的血清样本，再采用2种ELISA法试剂进行复查，对至少1种试剂检测结果在临界值（CLIA法S/CO﹥0.90，ELISA法S/ CO﹥0.80）以上的样本，采用荧光定量聚合酶链反应（realtime fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR）方法进行HCV核酸定量（HCV RNA）。结果 从本院临床患者中筛选出CLIA法抗-HCV S/CO﹥0.40的样本进行ELISA法检测，至少1种试剂检测结果在临界值以上的血清样本201例，其中强生CLIA、索林ELISA和科华ELISA法阳性率分别为2.5%（150/5 800）、1.6%（96/5 800）和1.5%（89/5 800）。CLIA及2种ELISA法试剂检测结果均呈阳性的样本75例，阳性率为1.3%（75/5 800）；FQ-PCR法检测结果阳性51例，阳性率为0.9%（51/5 800）。CLIA法检测抗-HCV S/CO﹥0.40且＜0.90的样本有40份，CLIA法检测抗-HCV S/CO﹥0.90且＜0.99的样本有8份；CLIA法检测抗-HCV S/CO≥1.0的样本有153例，其中S/CO 1.00～5.00的样本有66例，S/CO 5.01～10.00的样本16例，S/CO 10.01～20.00的样本5例，S/CO﹥20.00的样本66例。结论 对CLIA法检测抗-HCV S/CO﹥0.40且＜0.90的样本未发现漏检，建议直接发放阴性结果，减少试剂浪费；对CLIA和ELISA法检测抗-HCV阳性样本进行HCV RNA检测，并结合临床表现进行诊断及疗效评价。

化学发光法 酶联免疫法 丙型肝炎病毒抗体

丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）感染引起的，主要经输注污染的血液及血液制品传播。据世界卫生组织统计，全球HCV感染率约为3%，约1.8亿人感染了HCV，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例，呈全球性流行；可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞肝癌（HCC）[1]。HCV感染的标志物主要有抗-HCV和HCV RNA。抗-HCV是检测患者血清中针对HCV基因组编码抗原产生的抗体，间接反映HCV感染和既往感染。CLIA法检测精密度高、重复性好、高通量、可随机进样、操作简便[2]，目前，本实验室临床患者抗-HCV检测使用CLIA法，CLIA S/CO＞0.4时用2种ELISA法试剂复查。当CLIA和ELISA法至少1种试剂检测抗-HCV S/CO在临界值以上，进行HCV RNA检测。CLIA和ELISA法检测抗-HCV时，2种方法存在不一致性，因此在实际工作中建立可靠的复查方法，对HCV感染的诊断和疗效评价具有重要意义。本文对201例标本采用不同方法检测抗-HCV和HCV RNA，现报告如下。

材料与方法

1 材料 2013年1月～2014年10月，本院临床送检的201份患者血液样本（CLIA法检测抗-HCV S/ CO＞0.90或1种ELISA法试剂检测抗-HCV S/CO＞0.80）。

2 试剂

2.1 抗-HCV检测：美国强生HCV抗体CLIA试剂盒（批号3490，3480，3460）：检测结果≥1.00，判为抗-HCV阳性；检测结果＜0.90，判为抗-HCV阴性；检测结果≥0.90且＜1.00，属于边界线样本。

意大利索林公司HCV抗体ELISA法诊断试剂盒（批号V915120，V918410，V916610）：临界值（Cut-off）计算是将一个阴性对照值或阴性对照的平均值加0.6（阴性对照平均吸光度值＜0.25）；检测样本的吸光值小于临界值，说明检测样本抗-HCV阴性；检测样本的吸光值大于临界值，说明检测样本抗-HCV阳性。

上海科华生物工程股份有限公司H C V抗体E L I S A法诊断试剂盒（批号2 0 1 4 0 3 0 1 1，201307021，201209031）：S/CO≥1.00，说明检测样本抗-HCV阳性，S/CO＜1.00，说明检测样本抗-HCV阴性。

2.2 HCV RNA检测：上海科华HCV RNA定量检测试剂盒，检测结果﹥1.0×103拷贝/ml为阳性。3 仪器

3.1 抗-HCV检测：深圳爱康公司Uranus AE 280全自动酶免仪；美国强生公司VITROS 5600全自动生化免疫分析仪、VITROS 3600全自动免疫分析仪。

3.2 HCV RNA检测：上海宏石SLAN。

4 方法 见图1。

图1 检测方法流程图

5 统计学处理 应用SPSS17.5软件分析，采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 对201例（CLIA法检测抗-HCV S/CO ＞0.90或1种ELISA法试剂检测抗-HCV S/CO ＞0.80）患者血清样本检测抗-HCV及HCV RNA，结果见表1。

2 强生CLIA法检测结果S/CO＞0.40且＜1.0的样本有48例，2种ELISA法试剂复查结果见表2。CLIA法 S/CO范围在0.40～0.89时，索林和科华ELISA法试剂检测阳性率的差异无统计学意义；CLIA法S/CO≥0.90且＜1.00时，索林和科华ELISA法试剂检测阳性率的差异有统计学意义。

3 强生CLIA法检测结果S/CO≥1.0的样本有153例，2种ELISA法试剂复查结果见表3，强生CLIA法S/CO范围在1.00～20.00时，CLIA和ELISA法检测阳性率的差异均有统计学意义。S/CO 的范围＞20.00时，CLIA和ELISA法检测结果的符合率为100%。见表3。

表1 201例患者血清样本抗-HCV及HCV RNA检测结果

表2 ELISA复查CLIA检测抗-HCV S/CO＞0.40且＜1.0的结果

4 对201例患者血清样本进行3种方法检测，HCV RNA含量＜1.0×103拷贝/ml时，3种方法的结果存在不符合性；HCV RNA含量＞1.0×103拷贝/ml时，3种方法检测结果的符合率为100%。见表4。

表3 ELISA复查CLIA法检测抗-HCV S/CO≥1.00的结果

表4 3种方法检测201例样本的结果比较

HCV是导致慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌发生的主要因素。中国疾病预防控制中心传染病疫情报告数据显示，近年来我国丙肝发病人数逐年上升，最近5年内报告人数增加了5倍。因此，丙型肝炎的早期诊断显得十分重要。丙型肝炎的诊断，除症状、体征及肝功能检查外，主要依靠血清病毒学检测[3]。抗-HCV是目前诊断丙型肝炎的主要指标，反映HCV感染的存在，主要采用酶联免疫法（ELISA）和化学发光法（CLIA）。ELISA法是利用基因工程从HCV RNA获得结构区和非结构区HCV抗原包被于固相载体上，用间接法测定HCV抗体，本实验室用于检测抗-HCV的ELISA法试剂为第3代，其特异性、灵敏度都较好，且成本低、操作方便，适用于大批量样本检测；但亦存在操作步骤多、实验耗时长、窗口期较长的缺点。CLIA法的检测原理与ELISA相似，是基于抗-HCV 3.0 ELISA法设计，区别在于CLIA法是在反应杯中加入一种含发光底物及一种含电子转移物的试剂，酶结合物中的HRP催化鲁米诺衍生物发生氧化反应，并产生光，电子转移物增强了光的强度，最后由检测系统读取光信号，HRP结合物的量与样本中HCV抗体的浓度成正比。CLIA法方便、快捷、重复性好、时间短（有利于缩短报告的发布时间），灵敏度高，适用于临床抗原、抗体的检测，但成本较高。通过本组资料可以发现：检测201例患者血清样本抗-HCV，强生-CLIA法检测阳性150例，MUREX-ELISA法检测阳性96例，科华-ELISA法检测阳性89例。CLIA和ELISA法检测抗-HCV存在较大差异，原因可能与试剂包被的抗原及方法学不同有关，强生CLIA法试剂包被的HCV编码抗原是c22-3、c200（c200由HCV基因组NS3和NS4编码）和NS-5；索林-ELISA法试剂包被的抗原为核心抗原（结构区）、NS-3、NS-4、NS-5；科华-ELISA法试剂包被的是合成多肽抗原、核心抗原、非结构区抗原。索林和科华试剂所包被抗原及方法学相近，所以两者结果差异较小。CLIA S/ CO＞20.00时，ELISA S/CO＞0.80的样本数都为66例，检测结果为强阳性时，CLIA和ELISA法检测抗-HCV的符合率为100%。在抗-HCV检测中，CLIA法检测阳性率较高，为防止漏检并排除假阳性，对CLIA S/CO＞0.40样本进行ELISA法复检后发现，虽然未有漏检，但两种方法都存在假阳性率，给实际工作带来不便；因此本实验室在遇到CLIA和ELISA法检测结果不符合（CLIA法检测抗-HCV S/CO＞0.90或ELISA法检测抗-HCV＞0.80）时，建议进行HCV RNA检测。对于CLIA法检测抗-HCV S/CO＞0.40且S/CO＜0.90的样本，建议直接发放阴性结果，减少复查时试剂的浪费，控制成本。

HCV RNA是判定HCV感染的直接证据，具有确诊和抗病毒疗效评估的价值[2]，但HCV RNA定量检测技术成本高，对实验环境和操作人员技术水平要求高，不利于大批量样本检测[4]。目前，广泛应用于临床诊断和血液筛查的HCV抗体检测试剂都已发展到第3代，HCV RNA检测技术也较成熟，但由于方法学的局限性，抗-HCV和HCV RNA会出现结果不一致的情况。本次实验表明，抗-HCV阳性率明显大于HCV RNA，可能原因有：ELISA和CLIA法本身存在局限性，CLIA和ELISA法试剂都为第3代丙型肝炎抗体筛查试剂，易受体内非特异性IgG干扰而导致假阳性[5]；患者处于急性丙型肝炎的恢复期，HCV停止复制，HCV RNA滴度低，导致结果为阴性，抗-HCV仍可存在一定时间[5]。

本研究的201例样本中有51例经3种方法检测结果都为阳性；24例样本CLIA和ELISA法阳性而PCR法检测结果为阴性。推测可能与HCV感染后抗-HCV与HCV RNA的变化规律有关[5]：病毒感染1～3周后，HCV RNA可在外周血检测出来，在慢性感染中，HCV RNA常在高峰期后下降到较低水平，低于最低检测限。大多数丙肝患者抗-HCV持续很久甚至是终身存在，有效抗病毒治疗后抗-HCV也不一定转阴。目前，CLIA和ELISA法检测抗-HCV的结果存在不符合性，联合ELISA法检测抗-HCV可筛出部分假阳性样本，降低假阳性率；建议临床对CLIA和ELISA法检测抗-HCV阳性样本进行HCV RNA检测，并结合临床表现进行诊断及疗效评价。

1 丁华，何维娜，陈望，等.3种检测方法在丙型肝炎诊断中的临床评价[J].国际检验医学杂志，2013，34（24）：3387-3388．

2 张金良，白燕，邓庆梅.丙型肝炎病毒核酸定量检测的意义[J].实用肝脏病杂志，2006，7（4）：218-219．

3 白广红，张玲玲，孙文利，等.第四代抗-HCV试剂盒对无偿献血者筛检价值评价[J].现代医学检验杂志，2012，27（6）：116-117．

4 周永香.丙型肝炎病毒抗体与丙型肝炎病毒核糖核酸的关系[J].医学理论与实践，2003，16（8）：890-891.

5 邓麟宇，刘凤君，杨家红，等.丙型肝炎患者血清丙型肝炎病毒核糖核酸与丙型肝炎抗体及肝功能的检测[J].临床荟萃，2008，23（22）：1600-1603.

Study on the Rechecked Strategy of Antibody to Hepatitis C Virus

ZHANG Jing，SHAO Chun-yan，ZHUO Hailong，
et al. The 307th Hospital of Chinese People's Liberation Army 100071

Objective To Investigate the rechecked strategy of chemiluminescence immunoassay（CLIA）combined with enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）in order to detect Hepatitis C virus antibodies. Methods Two hundred and one sera samples of CLIA anti-HCV S/CO﹥0.40 were collected from the patients by ELISA. and the samples over the cutoff value with at least one reagent detection were checked for HCV RNA by realtime fluorescence quantitative PCR（FQ-PCR） . Results Among the positive 201 samples，CLIA provided by Johnson，ELISA by MUREX，and ELISA by Kehua companies revealed positivities of 2.5%，1.6%，and 1.5%，respectively. There were 75（1.3%，75/5 800）samples that had both CLIA and two ELISA reagents positive detections. FQ-PCR positive detections were noted in 51（0.9%，51/5 800）samples. Forty samples exhibited anti-HCV S/CO﹥0.40 and ＜0.90 in CLIA detection. Eight samples showed anti-HCV S/CO﹥0.90 and ＜0.99 in CLIA detection. There were 153 samples that revealed the anti-HCV S/CO≥1.0 in CLIA detection，among them，66 samples indicated S/CO 1.00-5.00，16 samples，S/CO 5.01-10.00；5 samples，S/CO 10.01-20.00； and 66 samples，S/CO﹥20.00. Conclusion CLIA is reliable for detection of anti- HCV with S/CO﹥0.40 and ＜0.90. HCV RNA detection is useful for laboratory diagnosis and treatment evaluation in the samples that have showed positive anti-HCV by using CLIA and ELISA.

Chemiluminescence immunoassay Enzyme linked immunosorbent assay Hepatitis C virus antibody

R446.11 R512.6+3

A

1671-2587（2017）04-0358-04

2016-12-16）

（本文编辑：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.04.014

100071 中国人民解放军第三〇七医院输血科

张菁（1987–），女，蒙古族，内蒙古呼和浩特人，技师，本科，主要从事血液检验工作，（Tel）15901132614（E-mail）465933707@qq.com。

骆群（1967–），男，硕士生导师，副主任医师，主要从事临床输血研究，（Tel）010-66947206（E-mail）luoq66@aliyun.com。