HBsAg、抗-HCV、抗-HIV酶免阴性及单试剂反应性献血者核酸检测结果分析*

严凤好 钟展华 李雪群 万小春

HBsAg、抗-HCV、抗-HIV酶免阴性及单试剂反应性献血者核酸检测结果分析*

严凤好 钟展华 李雪群 万小春

目的 通过对HBsAg、抗-HCV、抗-HIV酶免结果双阴性及单试剂反应性献血者进行核酸检测（NAT），分析两种检测方法的结果差异和鉴别试验的反应性项目，为假反应性献血者的归队提供理论依据。方法 分别用两种酶免试剂对献血者血液进行HBsAg、抗-HCV、抗-HIV血清学检测，对酶免阴性及单试剂反应性标本8人份混样进行HBV、HCV、HIV三联核酸定性检测，对NAT呈反应性的标本进行鉴别试验确定反应性的具体标本。结果 31 065份血液标本中酶免双试剂阴性30254份，单试剂反应性241份，其中进口试剂180份，国产试剂61份，主要集中在HCV和HIV进口试剂，两者差异有统计学意义；进行8人份混样NAT检测共有54份呈反应性，包括46份HBV、3份HCV、5份HIV。拆分鉴别实验检出39份HBV，其中ELISA阴性标本鉴别出37份阳性，单试剂反应标本中鉴别出2份，未拆分出HCV、HIV阳性标本，总拆分阳性率为72.2% 。结论 酶免单试剂反应性结果的假阳性率较高，核酸检测能提高对病毒的检测能力，有效降低经输血途径传播病毒的风险，选择两者互补的检测模式，对酶免单试剂反应性献血者进行追踪随访和复查，可为假反应性献血者的归队提供理论支撑，有利于献血者的召回。

单试剂反应性 核酸检测 鉴别实验

降低输血相关病毒传播的风险是输血行业乃至全医疗行业、全社会所关注的问题，核酸检测（NAT）被公认为是降低血清学窗口期漏检风险及低病毒载量检出的最佳解决方法[1]。酶联免疫（ELISA）方法作为我国血源筛查中普遍使用的检测技术，在保障输血安全方面也起到重要作用，然而，因单试剂阳性结果不确定性和假反应性造成献血者被淘汰的概率非常大。据调查显示，全国每年因血液筛查不合格淘汰的献血者约20万人次，其中单试剂不合格淘汰的献血者约10万人次[2]。既浪费宝贵的血液资源，也损害了献血者身心和名誉，甚至给其家庭带来不必要的误会和困扰。本文通过对HBsAg、HCV、HIV酶免结果双阴性及单试剂反应性献血者进行核酸检测，分析两种检测方法的结果差异和鉴别试验的反应性项目，旨在为假反应性献血者的归队提供理论依据。

对象与方法

1 对象 惠州血站2016年2～7月自愿无偿献血者31 065名，献血者均符合健康检查要求。每位献血者留取2管标本，一管为5 ml EDTA-K2真空采血管（用于ELISA检测），一管为5 ml EDTA-K2分离胶真空采血管（用于NAT 检测）。NAT 管采集后4 h内离心，在标本采集后48 h内完成各项检测，不能完成的置-20℃密闭保存，并于7 d内检测。

2 试剂与仪器 S T A R全自动加样仪（瑞士HAMILTON），FAME24/20全自动酶免分析系统（瑞士HAMILTON），Ampli STAR 全自动核酸提取纯化仪（瑞士HAMILTON），ABI7500荧光定量PCR仪（美国ABI）。酶免试剂：乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）采用新创（批号2015095132）和Bio-Rad（批号20150703）；抗-HCV采用万泰（批号CS20150806）和Ortho（批号E X E 2 5 2）；抗-H I V采用万泰（批号I20150716）和DiaSorin（批号D363710）。核酸试剂：HIV-1RNA 、HCV RNA 、HBV DNA三联检核酸试剂（批号20160105）以及HIV-1 RNA、HCV RNA剂、HBV DNA 鉴别试剂均购自苏州华益美公司（批号20160105）。所用试剂均为经检验合格且在有效期内使用；所用仪器设备均按要求进行维护和保养，并确保仪器在正常工作状态下运转。

3 方法

3.1 酶免检测：将标本按要求进行离心处理，用不同的加样系统、不同的酶免分析系统同时检测，按各试剂的检测标准、操作规程进行操作。结果以S/CO≥0.80为反应性，两种试剂均无反应性的标本判定为试剂室温放至平衡后，使用STAR全自动加样仪进行全自动加样，采用FAME 24/20全自动酶免分析系统进行全自动处理。初检采用国产试剂、复检采用进口试剂；任一种试剂有反应性的标本需剪血袋辫子用原试剂进行双孔复查，复查双孔均无反应性判定ELISA 阴性，否则判定ELISA 阳性。

3.2 核酸检测：挑出酶免双阳性标本，对酶免阴性及单试剂阳性的标本采用8人份样本混和检测模式进行HIV-1RNA 、HCV RNA 、HBV DNA 三联核酸检测，无反应性的标本为NAT 阴性，对有反应性的混合标本分别进行拆分鉴别检测，以确定具体的阳性标本。拆分检测后呈反应性的标本判为不合格，无反应性的标本为合格。

4 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行分析统计，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 ELISA试剂单检阳性情况 31 065份标本中有570份呈双试剂阳性，241份呈单试剂反应性，其中进口试剂180份，国产试剂61份，进口HCV和HIV试剂较高，分别为0.17%和0.28%，与国产试剂的差异有统计学意义，见表1 。

表1 2016年2～7月ELISA试剂单检阳性情况

2 ELISA阴性与单试剂反应性标本NAT检测情况剔除酶免双阳性标本后共有30 495份标本进行了8人份混样NAT检测，通过对反应性标本进行拆分鉴别发现，30 254份ELISA阴性标本NAT鉴别出37份阳性，241份单试剂反应标本中鉴别出2份阳性，见表2。

表2 30 495份标本ELISA与NAT检测结果

3 NAT混检阳性标本拆分鉴别情况 30 495份标本进行8人份混样NAT检测共检出54份反应性，包括46份HBV、3份HCV、5份HIV。拆分鉴别实验检出39份HBV，总拆分阳性率为72.2% ，未拆分出HCV、HIV阳性标本，见表3。

表3 NAT混检阳性标本拆分鉴别结果

讨 论

2015年3月国家卫生和计划生育委员会在《关于做好血站核酸检测工作的通知》中明确规定，2015年血站核酸检测要覆盖全国[3]。虽然近年来ELISA试剂盒的灵敏度、特异性不断改进，但仍然无法避免病毒感染窗口期、病毒变异、免疫沉默等因素造成的漏检[4，5]，NAT检测可将HBV、HCV和HIV感染的平均窗口期分别由56 d、70 d、22 d缩短为41 d、12 d和11 d[6，7]，而且不受病毒变异、个体免疫因素影响，使输血感染相关病毒的风险降到最低，极大程度地保障血液安全。

之前，我站采用两种酶免试剂（一种国产一种进口）对献血者标本进行检测，开展核酸检测后，为节约成本，选择一种酶免试剂联合一种核酸试剂进行检测，然而，该保留何种试剂必须经过可靠的评估。从实验结果来看，ELISA试验的假阳性率还是较高，尤其是本站目前所使用的HCV和HIV进口试剂，与国产试剂的差异有统计学意义（P＜0.05），除了与试剂的灵敏度有关外，还可能由以下因素引起[8]：标本溶血、脂血或血浆中存有纤维蛋白等物质；加样或洗板过程中出现交叉污染或拖带现象；不同生产厂家使用的抗原抗体原料不同；人体内其他非病毒抗体的干扰等。HIV使用第四代试剂后，增加了P24抗原检测，灵敏度大大提高；同时，由于部分正常人血清可能存在对P24抗原检测造成干扰的物质，导致阳性率较高。因试剂原因出现假阳性结果造成血液报废，提示应该选用高质量试剂进行检测。核酸检测方面，2016年2～7月，排除双阳性血样后，本站共有30 495份标本进行8孔混样NAT检测，检出54例反应性，拆分确认后共鉴别出39例HBV DNA（30 254份ELISA阴性中检出37例，241份ELISA单阳性中检出2例），HBV DNA的拆分阳性率为84.8%，未拆分出HCV RNA和HIV RNA，总拆分阳性率为77.2%，高于程卫芳等报道的59%[9]和田耘博等报道的37%[10]，可能与所选试剂及处理方法有关。有研究表明，HBV、HCV病毒经9.6倍超浓缩处理后，含量分别是原有含量的5.92±1.98倍和4.7±1.43倍，有利于提高NAT检测灵敏度和提高筛查反应性标本的鉴别阳性率[11]。本研究中酶免阴性标本HBV DNA 的检出率为1.21‰（37/30 414），比重庆[10]、南京[12]等地区略高，与广东地区乙肝流行率高有关，本站开展NAT检测后至少规避了1/818的输血感染HBV风险。

从实验结果可以看出，NAT在降低经输血传播病毒的风险中发挥举足轻重的作用，特别是对于HBV的传播，与血清学的“补漏”效果较好，与国内外学者的研究结论相一致[13，14]。ELISA与NAT两种方法检测的病毒标志物不同，各标志物在外周血中存在时间亦有差别，提示这两种检测技术均可能出现漏检和假阳性，二者联合应用筛查血液更能提高血液安全性。对于HBsAg、HCV、HIV 项目ELISA单试剂阳性的献血者，建议采供血机构对其进行追踪，让其进入重新归队程序，24周后再次采血进行ELISA和NAT检测[15]，结果均为阴性者可重新归于献血者队伍进行献血，结果仍为单试剂阳性的献血者可以通过确证试验来鉴别，确证试验阴性的献血者可进入下一轮追踪检测。这一方面是对献血者负责；另一方面也能最大限度地保留壮大无偿献血队伍。

无偿献血工作任重道远，血液安全至关重要，在ELISA检测的基础上增加NAT检测很有必要，如何结合实际情况，选择最适合的检测模式是各血站需要慎重考虑的问题。

1 Laperche S．Blood safety and nucleic acid testing in Europe[J]．Eurosurveill，2005，10（1）：3-4．

2 孟毓，卢涛，张艳梅，等.单试剂有反应性献血者延期并归队献血的可行性探讨[J].中国输血杂志，2013，26（1）：70-71.

3 国家卫生和计划生育委员会.关于做好血站核酸检测工作的通知.国卫办医发〔2015〕11号.2015.

4 许文燕，邱茂锋，佐合拉・吐尔地，等．第四代HIV抗原抗体酶联检测试剂缩短HIV检测窗口期的研究[J]．中华检验医学杂志，2007，30（3）：284-287．

5 孙桂香，吴月清.1026例输血前患者血HBsAg、抗HCV、抗HIV和梅毒抗体检测结果分析[J].标记免疫分析与临床，2015，22（1）：18-19.

6 Busch MP．HIV，HBV，and HCV：new developments related to transfusion safety[J]．Vox Sang，2000，78（suppl2）：253．

7 谢敬文，蓝文莉，黎淑贞，等.番禺地区无偿献血者酶免阴性样本的核酸检测结果分析[J]．临床输血与检验，2014，16（4）：355-357．

8 樊璐，傅颖媛. ELISA方法与NAT方法检测HIV结果分析[J]. 江西医药2011，46（9）：853-855.

9 程卫芳，段有红，周学勇，等．2种核酸检测平台在与ELISA平行检测中的应用[J]．中国输血杂志，2013，26（12）：1235-1237．

10 田耘博，黄霞，秦伟斐，等. 血液病毒核酸检测单独阳性标本研究[J].实验与检验医学，2015，33（6）：704-707，716.

11 王卓妍，龚晓燕，宋美兰，等．超速离心浓缩技术富集HBV和HCV颗粒的效果研究[J]．中国输血杂志，2012，25（12）：1295-1296．

12 黄成垠，蒋昵真，朱绍文，等. 1种血液核酸筛查系统的应用评价[J].中国输血杂志，2012，25（10）：1010-1011.

13 Candotti D，Lin CK，Belkhiri D，et a1．Occult hepatitis B infection in blood donors from South East Asia：molecular characterisation and potentialmecha nismsofoccurrence[J].Gut，2012，61（12）：1744-1753．

14 刘峭梅，覃柳. 献血者血液单人份核酸检测及血清学检测结果的分析[J]. 检验医学与临床.2014，11（1）：102-104.

15 丁卫平，郑拉让，李晶. HBsAg、HCV、HIV单试剂有反应性献血者的归队分析及探讨[J].按摩与康复医学，2015，6（21）：122-124.

Analysis of Nucleic Acid Tests in HBsAg，Anti-HCV，Anti-HIV ELISA Negative or Single Reagent Reactive Blood Donors

YAN Feng-hao，ZHONG Zhan-hua，LI Xue-qun，et al. Huizhou Blood Center，Huizhou，516000

Objective Nucleic acid tests were performed in the blood donors and compared with the results of ELISA double negative and single reagent reactive in HBsAg，Anti-HCV and Anti-HIV so as to provide a basis for distinguishing the false positive blood donors. Methods Two ELISA reagents were used to detect seral HBsAg，HCV and HIV in the donors，and 8 specimens of ELISA negative and single reagent positive samples were subjected to DNAs detections. All DNAs positive samples were identified. Results In 31 065 blood samples，30 254 cases were found to be negative with double ELISA，and 241 cases were positive with single reagent examination，among them 180 cases were detected with imported kits and 61 with domestic reagents. A significant difference was seen in different reagents. DNAs detection showed 54 positive samples including 46 HBV，3 HCV，and 5 HIV. Identification tests revealed 39 positive HBV，among them 37 and 2 cases were found from ELISA negative and single reagent positive samples，respectively. Neither HCV nor HIV was discovered and total positive rate was 72.2%.Conclusion ELISA single reagent reactive result gives rise to a high false positivity while DNAs examination may improve the efficacy of virus diagnosis. Complementaryexaminations are recommended so as to induce the risk of blood transfusion of infectious diseases.

Single reagent reactive Nucleic acid detection Identification tests

R446.61 R392.11

A

1671-2587（2017）04-0379-04

2017-01-30）

（本文编辑：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.04.020

*本课题受惠州市科技计划项目资助（项目编号：2015Y125）

516000 广东省惠州市中心血站

严凤好（1980–），女，广东惠州人，副主任技师，硕士，主要从事血液检测和临床输血技术工作，（Tel）13725046736（E-mail）775443294@qq．com。