血清AChRab、PsMab和CAEab检测在胸腺异常患者中的诊断意义

武茜 顾萍 姚娟 邓晓萱 程虹 万琪 张克忠 陈亮 徐心峰

血清AChRab、PsMab和CAEab检测在胸腺异常患者中的诊断意义

武茜 顾萍 姚娟 邓晓萱 程虹 万琪 张克忠 陈亮 徐心峰

目的探讨血清抗乙酰胆碱受体抗体(AChRab)、抗突触前膜抗体(PsMab)和柠檬酸提取物相关抗体(CAEab)在胸腺异常患者中的诊断价值。方法回顾性收集2009—2016年作者医院收治的经病理检查证实存在胸腺异常的患者152例，同时收集健康体检者45名(NC组)和其他神经系统疾病患者35例(OND组)作为对照组。采用ELISA方法检测各组AChRab、PsMab和CAEab水平，比较各组不同抗体阳性率的差异，并进一步比较不同胸腺异常者间各抗体阳性率差异。结果(1)胸腺瘤、胸腺增生组血清AChRab、PsMab和CAEab阳性率明显高于NC及OND组(均P<0.01)，且胸腺瘤组上述3种抗体阳性率高于胸腺囊肿组(P<0.01或P<0.05)。胸腺囊肿组与NC及OND组各抗体阳性率比较无统计学差异(P>0.05)。 CAEab对胸腺瘤患者诊断灵敏度为60.6%，特异度为88.8%。(2)重症肌无力合并胸腺瘤(MGT)组PsMab阳性率高于非合并MG胸腺瘤(NMGT)组(P<0.05)，而其AChRab及CAEab阳性率与NMGT组比较无统计学差异(P>0.05)。(3)MGT组中，MGT-全身型组血清AChRab阳性率较MGT-眼肌型组增高(P<0.05)。(4)胸腺瘤不同病理分型患者间各抗体阳性率比较无统计学差异(均P>0.05)。结论(1)CAEab检测结合CT检查可作为临床可疑胸腺瘤、胸腺增生患者术前辅助诊断指标之一。(2)AChRab阳性可能与MGT患者重症肌无力严重程度有关，PsMab阳性可能跟MGT患者致病有关。

胸腺增生；胸腺瘤；纵隔囊肿；重症肌无力；乙酰胆碱受体抗体；抗突触前膜抗体；柠檬酸提取物相关抗体

胸腺异常可表现为胸腺增生、囊肿或胸腺瘤等。既往研究发现，约70%～80%的重症肌无力(MG)患者存在胸腺异常，切除胸腺后MG患者血清乙酰胆碱受体抗体(AChRAb)减少，细胞免疫和体液免疫均受到抑制，其临床症状可得到有效缓解，因此认为胸腺在诱导和维持MG的发生、发展过程中起非常重要的作用[1-4]。近年来关于胸腺瘤合并MG患者抗体检测的报道较多，但针对单纯胸腺增生、胸腺囊肿以及未合并MG胸腺瘤(NMGT)患者抗体检测的报道较少，有关MG合并胸腺瘤(MGT)不同临床分型及胸腺瘤组织学分型的多种抗体检测的报道亦尚少。本文通过分析152例经CT和胸腺切除术后病理检查确诊的胸腺异常患者的临床特征及血清AChRab、抗突触前膜抗体(PsMab)和柠檬酸提取物相关抗体(CAEab)水平，旨在探讨不同胸腺异常与MG发病的关系及此3种抗体检测在胸腺异常中的诊断意义。

1 对象和方法

1.1研究对象收集2009-04—2016-05作者医院收治的经CT和术后病理确诊的胸腺异常患者152例，所有患者进行AChRab、PrsMab和CAEab检测。其中男80例，女72例，年龄18～84岁，平均(45.0±12.4)岁。152例患者中，存在胸腺瘤者104例，胸腺增生30例，胸腺囊肿18例。104例胸腺瘤中，NMGT者48例，MGT 56例(根据其临床表现、肌电图和新斯的明试验确诊，按改良Osserman分型：Ⅰ型18例，ⅡA 19例，ⅡB 7例，Ⅲ型12例；根据术后胸腺瘤组织分型：上皮细胞型44例，淋巴细胞型17例，混合细胞型29例，恶性胸腺瘤10例，梭型细胞型4例。选择健康体检者45名作为健康对照组(NC组)，其中男27名，女18名，年龄21～61岁，平均(46.0±11.7)岁。排除神经系统疾病及自身免疫性疾病，且经胸部CT检测未发现胸腺异常。另选取其他神经系统疾病35例(OND组)，其中男18例，女17例，年龄18～73岁，平均(52.2±10.9)岁。包括脑血管病10例，偏头痛8例，中枢神经系统感染10例，吉兰-巴雷综合征2例，周围神经病5例。胸腺异常组、NC组与OND组患者之间年龄与性别构成无统计学差异(均P>0.05)。

1.2方法采用ELISA法检测血清AChRab、PsMab和CAEab水平[5-7]。主要步骤如下。

1.2.1标本采集：采集肘静脉采血后迅速分离出血清，并于-70℃保存备用，1周内进行检测。

1.2.2骨骼肌肉提取液制备[5]：(1)取乳腺癌根治术患者胸大肌、胸小肌，截肢患者腿部肌肉，去筋膜，切成小块于-30℃保存备用，按Lindstroms法改良提取肌肉提取液。计算蛋白含量后分装，-30℃保存备用。工作浓度为l.4 mg/mL。(2)酶标板的包被：酶标板系上海华山医院神经病学研究所免疫室提供。(3)加入封闭液封闭，37℃ 1 h后4℃过夜。PBS-Tween(PBS-T)洗3次，加入稀释的肌肉提取液0.1 mL/孔。37 ℃ 2 h后PBS-T洗3次，于-70℃保存备用。

1.2.3CAE制备：按Aarli方法并略加改良制备，由上海华山医院神经病学研究所免疫室提供。主要步骤为：新鲜兔后腿肌肉加2倍体积PBS高速匀浆,以17904g离心15 min；留取沉淀物加冷丙酮搅匀，以17904g离心15 min；沉淀物用0.05 mol/L柠檬酸搅拌抽提后以403959g4℃离心 60 min，收集上清液并进行透析，用考马斯亮蓝法定量其蛋白浓度为5168 mg/mL。

1.2.4实验步骤：按参考文献[6-7]方法并稍作改良。(1)包被：将上述 CAE 抽提物、pH 9.5 碳酸盐缓冲液稀释至20 μg/mL，0.1 mL/孔包被96孔聚苯乙烯酶标板(上海塑料三厂)，2 h；PBS-T 洗涤3次。(2)封板：加入含5%(体积分数)小牛血清(pH 7.4，0.01 mol/L )的PBS-T，0.2 mL/孔，37℃温育1 h后4℃过夜，PBS-T洗3次，-70℃保存备用。(3)加样：经棋盘滴定法取 1∶5 稀释的待测血清，分别加入包被CAE及α-BGT、β-BGT结合有肌肉提取液的酶标板孔内，37℃温育2 h后，PBS-T洗涤3次；(4)加酶标抗体：用含2%(质量浓度)牛血清白蛋白的PBS-T 1∶1000稀释HRP-抗人IgG抗体，0.1 mL/孔，37℃温育1 h，PBS-T充分洗涤；(5)加底物A、B液：每孔0.05 mL，置室温10 min，终止液终止反应，用酶标仪检测450 nm下的吸光度〔D(λ)〕值。

1.2.5结果判定[6-7]：以待测血清平均D(λ)值与阴性对照血清(45名健康人混合血清)平均D(λ)值的比值进行判断，其比值>2.1为抗体阳性，其比值=2.1为弱阳性。

1.3统计学处理采用SPSS17.0软件进行统计学分析，计数资料以率表示，采用χ2检验或Fisher精确概率计算法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1胸腺异常与对照组抗体阳性率比较胸腺瘤组和胸腺增生组AChRab、PsMab和CAEab阳性率均高于NC组(χ2=15.323，P<0.01；χ2=19.270，P<0.01；χ2=30.978，P<0.01。χ2=7.084，P<0.01；χ2=8.933，P<0.01；χ2=13.920，P<0.01)，亦均高于OND组(χ2=17.931，P<0.01；χ2=19.315，P<0.01；χ2=31.661，P<0.01。χ2=10.672，P<0.01；χ2=10.672，P<0.01；χ2=16.404，P<0.01)。胸腺瘤组AChRab、PsMab和CAEab阳性率均高于胸腺囊肿组(χ2=8.524，P<0.05；χ2=4.550，P<0.05；χ2=4.635，P<0.05)。而胸腺瘤组与胸腺增生组之间、胸腺增生组和胸腺囊肿组之间3种抗体阳性率比较均无统计学差异(均P>0.05)。胸腺囊肿组、NC组及OND组3种抗体阳性率比较无统计学差异(均P>0.05)。结果见表1。CAEab对胸腺瘤患者诊断灵敏度60.6%，特异度跟NC组比较88.8%，跟NC+OND合并组比较CAE特异度为91.25%。

表1 各组患者血清AChRab、PsMab和CAEab阳性率比较〔n(%)〕

注：AChRAb：乙酰胆碱受体抗体，PsMab：抗突触前膜抗体，CAEab：柠檬酸提取物相关抗体，表2～4同；NC：健康对照；OND：其他神经系统疾病；与NC和OND组分别比较，aP<0.01；与胸腺囊肿组比较，bP<0.01，cP<0.05

2.2MGT组与NMGT组抗体阳性率比较MGT组PsMab阳性率高于NMGT组(χ2=5.246，P=0.022)，而AChRab和CAEab阳性率两组间比较差异均无统计学意义(χ2=0.544，P=0.461；χ2=0.188，P=0.665)。结果见表2。

表2 MGT和NMGT组3种抗体阳性率比较〔n(%)〕

注：MGT：合并重症肌无力胸腺瘤，表3同；NMGT：未合并重症肌无力胸腺瘤；与NMGT组比较，aP<0.05

2.3不同临床分型MGT患者抗体阳性率比较根据Osserman分型，将MGT患者分为MGT-Ⅰ(即MGT眼肌型)、MGT-ⅡA、 MGT-ⅡB和MGT-Ⅲ型亚组(后3型为MGT全身型)，MGT-ⅡA、MGT-ⅡB和MGT-Ⅲ型亚组AChRab阳性率高于MGT-Ⅰ型组(均P<0.01)，且MGT-ⅡB型亚组AChRab和PsMab阳性率高于MGT-ⅡA型亚组(均P<0.01)，其PsMab阳性率低于MGT-Ⅲ型亚组(P<0.05)。MGT全身型组AChRab阳性率较MGT眼肌型增高(χ2=5.396，P=0.020)，而两组间PsMab(χ2=0.042，P=0.838)和CAEab(χ2=1.768，P=0.184)阳性率比较均无统计学差异。结果见表3。

表3 MGT不同临床分型患者3种抗体阳性率比较〔n(%)〕

注：与MGT眼肌型组比较，aP<0.05，bP<0.01；与MGT-ⅡA组比较，cP<0.01；与MGT-Ⅲ组比较，dP<0.05

2.4不同胸腺瘤病理分型患者抗体阳性率比较104例胸腺瘤患者中，以上皮细胞型所占比例最高，达42.3%(44/104)，以梭型细胞型最低，为3.8%(4/104)。不同胸腺瘤病理分型患者间AChRab、PsMab以及CAEab阳性率比较均无统计学差异(均P>0.05)。结果见表4。

表4 104例胸腺瘤患者不同组织病理分型3种抗体阳性率比较〔n(%)〕

3 讨论

MG是一种主要由AChRab与神经-肌肉突触上的乙酰胆碱受体(AChR)结合，导致神经信号传导障碍自身免疫性疾病。胸腺异常与MG的发病关系密切，是引起MG发病的重要原因之一。早在胸腺切除术成功治疗MG之前，即有研究结果显示MG与胸腺功能紊乱之间存在相互关系[8]，约75%的MG患者存在不同程度的胸腺异常，其中85%为胸腺增生，胸腺瘤占15%[9]。

MG患者机体产生的AChRab大部分在胸腺内合成，参与破坏AChR的T淋巴细胞在胸腺内致敏，引起MG自身免疫反应的始动抗原(即肌样细胞)也存在于胸腺。因此目前有关MG各种治疗方法的目标基本是针对抗体、淋巴细胞和胸腺组织。手术切除胸腺可避免神经-肌肉接头处的AChR永久不可逆性损害，是阻断这种病理过程有效手段：可清除胸腺生发中心内的抗体生成细胞；清除提供抗原刺激的类肌细胞和胸腺瘤细胞；可清除记忆T细胞和辅助T细胞产生和成熟的基地，这两种T淋巴细胞在协助、诱导B淋巴细胞产生自身抗体中起着重要的作用[2]。AChR和PsmR是分别可以与α-银环蛇毒素(α-BuTx)、β-BuTX结合的蛋白，在MG发病中，AChRab主要以损害突触后膜为主，而PsMab可使突触前膜受损，从而影响囊泡的迁移、释放和肌纤维兴奋的收缩[10-11]。在MG(尤其是MGT)患者血清中存在着一种能与骨骼横纹肌起反应的自身抗体，该抗体能与胸腺中的肌样细胞起反应。这种骨骼肌CAE(柠檬酸粗提液)又称之为胸腺瘤相关抗原，具有器官特异性，存在于骨胳肌、心肌，也见于胸腺。目前CAEab检测报道多见于MGT患者[12-13]。

在组织学上，胸腺囊肿有鳞状上皮衬里，囊壁上有胸腺组织为主要诊断特征；在病理上，囊壁中胸腺组织所含甚少，多为囊性低密度水样或血性成分。本组胸腺囊肿患者CAEab阳性率为33.5%，上述3种抗体阳性率与NC组比较无统计学差异。MGT患者CAEab阳性率达62.5%，高于杨海龙等[14]的研究结果，与黄载慧等[12]报道的MGT患者CAEab阳性率为63.1%相似。与健康人胸腺相比，MG合并胸腺增生者其胸腺最显著的变化是淋巴滤泡生发中心形成[10]。多数早发型AChRab阳性MG患者伴有胸腺增生，胸腺淋巴组织增生和胸腺瘤在MG患者中可分别占65%和15%[15]。对MG患者增生的胸腺组织研究发现，其包含T细胞、B细胞、浆细胞和表达AChR的肌样细胞[16]。AChRab阳性易出现在胸腺增生和胸腺瘤患者中[17]，胸腺切除后患者AChRab抗体滴度下降，提示胸腺可能是诱发MG的起始部位。

本研究结果显示，胸腺瘤组、胸腺增生组AChRab、PsMab和CAEab阳性率均明显高于NC和OND组，提示该3种抗体与胸腺瘤、胸腺增生的发病有一定相关性；CAEab对胸腺瘤患者诊断的灵敏度为60.6%，特异度为88.8%(与NC比较)和91.25%(NC+OND组比较)；MGT组AChRab、Psmab和CAEab阳性率均高于NMGT组；MGT-全身型AChRab阳性率高于MGT-眼肌型组。PsMab作为一种MG致病中新的糖蛋白[10，18-19]被陆续报道，推测其升高可能与MGT病理机制有关。有研究认为AChRab和PsMab均阳性的患者可能同时有突触前膜和突触后膜的损害；而AChRab阴性PsMab阳性的患者可能以突触前膜的损害为主[11]，AChRab和PsMab存在一定的交叉反应性和相关性[10]。上述结果提示AChRab可能与MGT患者的临床分型和疾病严重度有关，PsMab和AChRAb与胸腺瘤的发生发展有一定关系，但确切机制有待进一步研究。

本研究进一步对胸腺瘤进行病理分型发现：胸腺瘤以上皮细胞型为主，占42.3%。这与高政等[20]报道的39.7%结果接近，高政等研究表明上皮细胞为主的胸腺瘤MG发生率高，且临床症状重，以Osserman分型ⅡA、ⅡB型为主，肌无力危象发生率高，死亡率高。上皮淋巴细胞型胸腺瘤MG发生率位居其次。本研究中PsMab阳性在上皮细胞型胸腺瘤中最高，AChRab阳性在恶性胸腺癌患者最高，CAEab阳性在淋巴细胞型患者中最高，而PsMab和AChRab在梭型细胞型胸腺瘤患者中占比最小。但本研究并未显示同一抗体在不同胸腺瘤组织病理分型间有统计学差异，有关该3种抗体在胸腺瘤组织分型中的作用机制尚需进一步研究。

大约50%的胸腺瘤患者ACRab阳性但无临床症状[21]，常表现为上纵膈肿块，在常规胸部体检时偶然被发现。NMGT患者往往由于缺乏特征性临床表现而诊断困难。CT是首选的影像学检查手段，但小胸腺瘤和胸腺淋巴组织增生常显示为局灶性软组织肿块[15]，尚不能对其进行区别。有研究显示， CAEab对MGT发病具有显著相关性，采用敏感而又特异的CAEab检测方法可早期发现胸腺瘤；中年以后MG患者行常规检测CAEab可避免漏诊；即使瘤体微小，CT扫描影像分辨不清也可辅助临床诊断；病程中动态复查抗体可发现隐藏或复发的肿瘤，有助于随访[13]。该研究中NMGT患者CAEab阳性率达58.3%，明显高于NC组。需注意的是，成批检测CAEab时可出现少数“假阳性”、“假阴性”,诊断必须结合临床。

综上所述，前纵膈肿瘤患者术前检测CAEab结合CT检查，能提高其诊断胸腺瘤或胸腺增生的敏感性。术前合并检测PsMab和AChRab对于评估是否存在MGT或将来可能发生MG有一定意义；针对AChRab和PsMab阳性的MGT患者宜采取胸腺切除手术治疗，并可根据术后病理分型指导治疗和判断预后。

致谢：本文工作得到上海华山医院神经病学研究所神经免疫室乔建老师以及南京医科大学第一附属医院病理科李明娜老师的大力支持，在此致谢！

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SignificanceofserumAChRab,PsMabandCAEabforthediagnosisofpatientswiththymicabnormalitiesandthymomawithmyastheniagravis

WUQian，GUPing,YAOJuan*，DENGXiaoxuan,CHENGHong，WANQi，ZHANGKezhong,CHENLiang,XUXinfeng.

*DerpartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,NanjingJiangsu210029，China

YAO Juan，Email：871504802@qq.com

ObjectiveTo explore the diagnostic value of serum anti-acetylcholine receptor antibody (AChRab), presynaptic membrane antibody (PsMab) and citrate extract related antibody (CAEab) in patients with thymus abnormalities.MethodsWe collected 152 patients with thymus abnormalities from 2009—2016, and collected 45 healthy subjects (NC group) and 35 patients with other diseases of the nervous system (OND) as another control group. The serum levels of AChRab, PsMab and CAEab of each group were detected by the ELISA method, and the positive rates of different antibodies in each group and patients with different kinds of thymus abnormalities were compared.Results(1) The positive rates of serum AChRab, PsMab and CAEab in the thymoma and thymic hyperplasia groups were significantly higher than those of the NC and OND group (allP<0.01), and the above three kinds of antibodies in the thymoma group were higher than those of the thymic cyst group (P<0.01 orP<0.05). There was no statistical significant difference in the positive rates of the three antibodies between the thymus cyst group and the NC and OND groups (P>0.05). The diagnostic sensitivity of CAEab to the patients with thymoma was 60.6%, and the specificity was 88.8%. (2)The positive rate of PsMab in the patients with myasthenia gravis combined with thymoma (MGT) group was higher than that in the non MG thymoma (NMGT) group (P<0.05), but the positive rates of AChRab and CAEab were not significantly different from those of the NMGT group(P>0.05). (3) In the MGT group, the serum AChRab positive rate of generalized MG patients was higher than that of the ocular MG group (P<0.05). (4) There was no statistical significant difference of the positive rate of antibodies in patients with different pathological subtypes of thymoma (allP>0.05).Conclusions(1) CAEab detection combined with CT can be used as one of the preoperative diagnostic indexes of patients with suspected thymoma and thymic hyperplasia. (2)AChRab serum level may be related to the severity of myasthenia gravis in patients with MGT；PsMab may be associated with MGT.

thymus hyperplasia;thymoma; mediastinal cyst; myasthenia gravis; acetylcholine receptors antibody; presynaptic membranes antibody; citric acid extract of skeletal muscle antibody

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.05.008

210029南京医科大学第一附属医院神经科(武茜、顾萍、姚娟、邓晓萱、程虹、万琪、张克忠)；210029江苏省人民医院胸外科(陈亮、徐心峰)

姚娟；Email：871504802@qq.com

R746.1

A

1006-2963(2017)05-0344-05

2017-03-01)

(本文编辑：时秋宽)